烟草腺毛特异高表达乙酰乳酸合酶基因在糖酯合成中的功能鉴定.pdfVIP

摘 要 茄科糖酯（又称酰基糖）在腺毛中特异合成，其不但具有抑菌、抗虫、抗微生物、抗氧化等 多种生物功能，而且在烟草中也是重要香气前体物，对烟草香气品质具有重要贡献，因此，挖掘 鉴定糖酯合成基因，揭示糖酯合成调控分子机制，对以提高糖酯含量为重要育种目标的茄科作物 育种以及糖酯的生物合成利用，均具有重要意义。近年来，有关茄科糖酯合成过程中酰基链与糖 环的组装及其关键调控基因的研究，在番茄和矮牵牛中已经取得较大进展。关于酰基链的形成机 制，以往研究认为是通过支链氨基酸合成途径合成，但目前鉴定获得的关键调控基因还较少。本 研究基于同源比对分析，挖掘支链氨基酸合成代谢的关键调控基因乙酰乳酸合酶基因3 个，结合 烟草腺毛和叶片转录组测序数据以及组织表达模式分析，发现其中一个乙酰乳酸合酶基因（定名 NtALS1 ）在腺毛特异表达，推测其可能参与烟草糖酯合成。本研究通过组织定位、亚细胞定位和 CRISPR Cas9 敲除技术，对该基因进行了系统的功能鉴定。研究结果表明，NtALS1 在腺毛腺头细 胞的叶绿体中特异表达，是烟草糖酯合成代谢的一个关键基因。主要研究结果如下： 1. 从茄科基因组网的 K326 基因组中搜索到 3 个 ALS 大亚基的同源基因（定名 NtALS1 、 NtALS2 和NtALS3 ），利用qRT-PCR 分析了其在烤烟品种红花大金元不同组织的表达状况。结果 表明，NtALS1 在腺毛中特异高表达，NtALS2 在7 个组织均有表达，NtALS3 几乎不表达。又将茄 科基因组网搜索的茄科其他同源 ALS 构建系统进化树，并通过基因克隆分析 NtALS1 的遗传来 源。结果表明，NtALS1 来源于祖先种绒毛烟草，与其聚为一类的同源ALS ，对应物种均含有糖 酯，可能在腺毛中特异表达，而不含糖酯的林烟草Nisyl-mRNA-72505 与NtALS2 、NtALS3 聚为 一类。 2. 克隆了红花大金元的NtALS1 启动子（定名NtALS1-P ），并构建NtALS1-P 驱动GFP 表达 的组织定位载体，以本氏烟草为受体，进行农杆菌侵染和瞬时表达，利用激光共聚焦显微镜采集 荧光信号。结果表明，GFP 信号仅在本氏烟草腺毛的腺头细胞出现，说明NtALS1 在这些细胞中 特异表达。 3. 利用亚细胞定位网站对NtALS1 进行预测，结果表明NtALS1 定位于叶绿体。进一步克隆 红花大金元NtALS1 的CDS 序列，构建35S 启动子驱动NtALS1 和GFP 共同表达的亚细胞定位 载体，以本氏烟草为受体，进行农杆菌侵染和瞬时表达，利用激光共聚焦显微镜采集荧光信号。 结果表明，NtALS1 的GFP 信号与叶绿体自发荧光信号重叠较好，说明NtALS1 定位于叶绿体。 4. 构建了含有3 个NtALS1 敲除靶位点的CRISPR Cas9 载体，以烤烟品种K326 为受体进行 遗传转化；通过转基因阳性株鉴定和靶位点测序，获得 T0 代突变体 14 株，将其中 ntals1-1 和 ntals1-2 突变体收种并播种T 代株系；通过转基因阳性株鉴定和靶位点测序，从ntals1-1 和ntals1- 1 2 的T1 代株系中分别获得6 株2 bp 碱基插入纯合突变体和4 株40 bp 碱基缺失纯合突变体；利用 GC/MS 技术，检测其中3 株ntals1-1 和2 株ntals1-2 T1 代纯合突变体材料的烟叶表面分泌物。结 果表明，两类突变体材料表面分泌物中主要二萜含量与野生K326 相比，没有显著差异，然而糖 酯含量显著低于对照。研究结果证明，NtALS1 是参与烟草糖酯合成的关键基因。 关键词：烟草，糖酯，乙酰乳酸合酶基因，功能鉴定 I Abstract Solanaceaes sugar esters (also known as acylsugars) are specifically synthesized in glandular trichomes. Sugar esters not only have a variety of biological