基于Cap蛋白的鹅星状病毒遗传进化、单抗制备及定量检测技术研究.pdfVIP

摘要 自2016 年 5 月以来，安徽、江苏、山东、云南、四川等养鹅场爆发一种以痛风为主要病症 的传染病，该病表现为腿关节腔充满白色浆液及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎，5-19 日龄雏鹅易感， 死亡率高达30%，给养鹅业及相关产业带来严重经济损失。本研究首先对实验室对2016-2019 年 从各地采集的RT-PCR 鹅星状病毒（Goose Astroviruses，GoAstV ）阳性临床发病鹅样品，进行回 顾性分析，对其中有时间和地区代表性毒株的ORF1b（编码RNA 依赖性RNA 聚合酶蛋白），ORF2 （编码病毒衣壳蛋白）基因序列比对分析。结果表明，样本LA1605，ZJ1703 ，ZJ1704，ADY1708 ， LY1912 与中国现已发表的多株鹅星状病毒基因序列同源性高达99.9%。 构建GoAstV Cap 原核表达载体pET-30a-rCap，转化BL21(DE3)后使用IPTG 诱导表达，通 过SDS和Western blot 检测蛋白的表达，大量表达并纯化带有His 标签的rCap 重组蛋白， 获得浓度为0.74 mg/mL 的重组蛋白。将纯化的蛋白作为免疫原免疫BALB/c 小鼠，采用酶联免疫 吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay ,ELISA ）检测免疫小鼠抗体效价，使用经典的细胞 杂交瘤技术制备单克隆抗体。通过Western blot 与免疫荧光试验（Immunofluorescent assay ,IFA ） 对单克隆抗体进行鉴定。结果表明，通过三次亚克隆最终获得5 株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞 株1A5G10、1C11B11、5B7G8、9A12B12、9C3E11，抗体效价ELISA 检测均可达1:51,200 以上； 1A5G10、5B7G8、9C3E11 重链为 IgG1 型，1C11B11、9A12B12 重链为 IgG2b 型，轻链均为κ 型；制备的单抗均可与重组蛋白反应或GoAstV 发生ELISA 反应；其中5B7G8 株与GoAstV 发 生Western blot 反应，1C11B11、9A12B12 株与GoAstV 发生Western blot 和IFA 反应。 以病毒衣壳蛋白 （Capsid protein ，Cap ）序列的5’端保守区为模板，设计荧光定量PCR 引物 和探针。以19T-Cap 重组质粒为阳性标准品模板，通过10 倍梯度稀释构建标准曲线，建立GoAstV Taq-Man 实时荧光定量RT-PCR 绝对定量检测方法。标准曲线线性方程为y = -3.4469x + 41.528， 2 R =0.9948 ；该方法最低可检测到3.98 个拷贝数/μl 的病毒，与其他病毒无交叉反应，且变异系数 小于2% 。 通过利用制备的单克隆抗体和建立的荧光定量 PCR 检测方法，分别对鹅星状病毒的体内外 增殖特性展开研究。采用口服、肌肉注射、皮下注射、滴鼻点眼4 种不同途径，对6 日龄雏鹅进 行接种鹅胚增殖的GoAstV-CH16 株，于攻毒后 1、2、3 周对4 组雏鹅进行随机剖检，并采取心 脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胰脏、腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠 12 个组织。通 过使用已建立的方法进行对各个组织样品进行病毒载量的检测。检测结果显示，鹅星状病毒感染 雏鹅后1 周体内病毒含量达到高峰，以各组织中口服攻毒途径病毒载量最高，其中肾脏病毒载量 最高。使用GoAstV-CH16 株感染鹅胚原代肾细胞（Goose embryo Kideny Cells，GKC ），对GoAstV 感染后的GKC 细胞进行Western-blot 和IFA 试验，收集GoAstV 感染后不同时间点的细胞培养液， 利用已建立的GoAstV Taq-Man 荧光定量PCR 绝对定量检测方法进行检测，绘制GoAstV 感GKC 的一步生长曲线。 关键词：鹅星状病毒，Cap 基因，荧光定量RT-PCR ，病毒载量，单克隆抗体 I Abstract Since May 2016, an infectious disease with gout as the main disease has erupted in goose farms in Anhu