透明质酸降解菌的筛选及其裂解酶的研究.pdfVIP

摘要 摘要 透明质酸是一种存在于生物体内的大分子糖胺聚糖，透明质酸寡糖具有一定 的生物免疫活性、良好的抗氧化性，有促进组织血液流动、血管生成和创伤愈 合等功能。透明质酸酶是一类糖苷酶，能将透明质酸降解成小分子透明质酸寡 糖，是制备透明质酸寡聚糖的有效方法，开发活性高、性质优良的新型透明质 酸酶以及获得具有生物活性的透明质酸寡聚糖具有重要的研究意义。本研究从 土壤中筛选出透明质酸高降解活性菌株，获得透明质酸裂解酶，并将该酶进行 异源表达、纯化、功能及酶学性质研究，主要研究内容和结果如下： 1. 透明质酸降解菌的筛选和鉴定 通过控制碳源富集、浊度法初筛、比色法复筛，从 80 份土壤、淤泥样品中 分离出13 株具有降解透明质酸的活性细菌，进一步通过在相同发酵条件下产酶、 测定并比较各个菌株酶活，最终挑选出活性最高的菌株BN3-1。对BN3-1 进行 16S rDNA 系统进化树分析以及细菌生理生化反应实验，最终确定该菌株为弗氏 柠檬酸杆菌，将其命名为 YNLX ，并保存于云南大学云南省微生物研究所菌种 保藏中心，保藏编号为YMF3.01173 。 2. 菌株YNLX 透明质酸裂解酶的克隆及异源表达 通过对菌株 YNLX 进行基因组测序分析，发掘到一个透明质酸裂解酶 YNLX-hyl ，Blast 比对结果表明尚未有实验数据揭示其高同源序列的功能性质， YNLX-hyl 与揭示过功能的透明质酸裂解酶的最高相似性只有30.9% 。 YNLX-hyl 在大肠杆菌中成功表达并纯化，在毕赤酵母中也获得表达。大肠 杆菌表达YNLX-hyl 的产量更大，比活为12816 U/mg 。 3. 重组透明质酸裂解酶YNLX-hyl 的功能及酶学性质 紫外法检测透明质酸裂解酶性质，YNLX-hyl 的最适反应pH 为 pH5.5 ，在 pH5.0~7.0 具有较高稳定性；最适反应温度为35°C，在0°C、10°C 和20°C 时仍 分别有约 10%、40%和 55%的活性，在温度高于40 ℃时酶稳定性差，表明该酶 是典型的低温酶。1 mmol/L 的AlCl 、FeCl 、CTAB、SDS、Tween 80 对该酶的 3 3 活力具有明显抑制作用，而 β-巯基乙醇对该酶的活力具有明显促进作用；在 5.0~20.0%(w/v) 的Na SO 和(NH ) SO 中，YNLX-hyl 具有良好的活性和一定的 2 4 4 2 4 稳定性。酶动力学分析显示YNLX-hyl 在最适反应条件下降解HA 的V = 13836 max U/mg ，Km=1.44 mM ，Kcat=9.85 s-1 。YNLX-hyl 能降解透明质酸和硫酸软骨素， I 摘要 对多聚半乳糖醛酸有微弱降解能力，对其他多糖类物质无降解活性。 经薄层层析法检测，YNLX-hyl 彻底降解透明质酸和硫酸软骨素的产物为不 饱和二糖，通过控制酶反应条件，可生成其他小分子寡糖。 利用超滤管超滤分离获得透明质酸和硫酸软骨素的酶解产物，发现透明质酸 和硫酸软骨素的酶解产物均具有清除羟自由基、氮自由基、超氧阴离子自由基 以及抗 ABTS 被氧化的能力，且该能力明显高于未降解的透明质酸和硫酸软骨 素。酶解获得的透明质酸混合寡糖、透明质酸二糖、硫酸软骨素混合寡糖、硫 酸软骨素二糖的氮自由基清除率分别为68.42%、73.21%、74.06%、77.73%，羟 自由基清除率分别为68.42%、78.74%、42.22 % 、52.55%，超氧阴离子自由基清 除率分别为62.28%、63.70%、63.75%、64.89%，抗ABTS 被氧化能力分别为62.24%、 61.39%、56.41%、57.43% 。小分子糖胺寡糖具有良好的抗