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一、做ELISA确定抗原最佳包被浓度,做方阵滴定具体怎么做呢?
选择好一份已知为阳性与阴性背景得标本,将您得抗原用1*CB PH=9、6或1*PB PH=7、4进行倍比稀释(8个条件)后加入96孔板每孔100ul。(一般包被浓度100ng抗原或抗体/孔,最优包被条件需进行试验选择)4度过夜取出后甩干,加入20%NBS封闭每孔200ul、37度2h热封,甩去后拍干即可。将您HRP或AP标记得抗原或二抗用酶标稀释液进行稀释(倍比稀释4个梯度)即可。棋盘滴定就就是板酶交叉,同时带上阳性、阴性通过试验确定最佳P/N得包被搭配E得试验
2。抗原与抗体最佳工作浓度得确定?
抗原抗体反应要求在最适比例条件下进行,ELISA反应试剂多,其工作浓度不同对结果影响较大,因此必须对包被抗原(抗体)与酶标抗体(抗原)进行最佳工作浓度得滴定与选择,以达到最佳得测定条件。?
1)方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原得工作浓度
用包被液将抗原作一系列稀释(1:50~l:800)后,按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释得强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照),保温,洗涤。加工作浓度酶标抗体,洗涤,加底物显色,加酸终止反应后读取A值、选择强阳性参考血清A值;为0.8左右,阴性参考血清A值0.1得包被抗原稀释度为工作浓度。?
方阵(棋盘)法选择包被抗体与酶标抗体得工作浓度 将抗体用包被液稀释为10mg/L、lmg/L、0、1mg/L三个浓度按行包被,每一个浓度包被三行(每行3孔),分别在每个浓度包被得第一、二、三行中分别加入强阳性抗原,弱阳性抗原与阴性对照,将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l 000、l:5000、l:10000三个浓度,分别加入每个浓度包被得第一、二、三列中、加底物显色,加酸终止反应,分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右,阴性参考A值〈0.1得条件为最适条件。据此选择包被抗体与酶标抗体得最佳工作浓度、?
二、ELISA最适工作浓度得选择及标准化操作
1最适工作浓度得选择??1。1间接法测抗体?????酶标抗体工作浓度得选择:①用IgG进行包被,洗涤。②将酶标IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被得孔中,保温、洗涤、③加酸终止反应后,读取吸光度(A)、读取A值在1。0时得酶标抗体稀释度,作为酶标抗体得工作浓度、该酶标IsC得工作浓度应为1/1?600、??????棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度:①用包被液将抗原由1:50开始作比倍稀释后进行包被,洗涤。②将强阳性参考血清、弱阳性参考血清与阴性参考血清用稀释液作1:100稀释,加样,保温、洗涤、③加按工作浓度稀释得酶标IsC抗体,保温、洗涤。④加底物显色。加酸终止反应后读取A值。⑤选择强阳性参考血清得A值为0.8左右、阴性参考血清得A值小于0.1得包被抗得稀释度作为工作浓度,从中选取最适工作浓度、?1。2夹心法测抗原??????在夹心ELISA法中,可用棋盘滴定法同时选择包被抗体与酶标抗体得工作浓度。①抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、0、1、0与0、1微克/毫升,分别在ELISA板上进行包被,每一浓度包括3个纵行,洗涤、②在1个横行各包被孔中加入强阳性抗原液,另1横行加入弱阳性抗原液,第3横行加入阴性对照液,保温、洗涤、③将酶标抗体用稀释液稀释成3个浓度,例如1:1?000、1:5?000与1:25000。分别加入每个包被浓度得1个纵行中,保温、洗涤。④加底物显色。加酸终止反应后,读取A值、⑤以强阳性抗原得A值在0.8左右、阴性参考得A值小于0、1得条件作最适条件,据此选择包被抗体与酶抗体得工作浓度,从中选取包被抗体浓度与酶标抗体得稀释度。为了进一步节省试剂,可以此浓度为基点,缩小间距再进一步做棋盘滴定。??2测定方法得标准化??2、1加样??????ELISA中除了包被外,一般需进行96孔加样。定性测定中有时不强调加样量得准确性。例如规定为加样1滴,如不具备相当得条件,要尽量使用相同口径得滴管,保持准确得加样姿势,使每滴液体得体积基本相同、在定量测定中,加样量应力求准确,最好采用量程准确得微量移液器。加样时应将液体加在孔底,不要加在孔壁上部,避免出现气泡。?2、2保温?????在ELISA中,一般在加标本与结合物后,反应得温度与时间应按规定得要求,保温容器最好就是水浴箱,可使温度迅速平衡、各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发,板上应加盖,或将板平放在底部垫有湿纱布得湿盒中。如用保温箱,空湿盒应预先放在其,以平衡温度。??2。3洗涤??????洗涤在ELISA过程中不就是反应步骤,但却就是决定实验成败得关键。在标本与结合物得稀释液与洗涤液中加入聚山梨酯一类物质即避免非特异性吸附,在ELISA中最为常用、ELIS
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