光系统Ⅱ重要氨基酸残基D1-N338和D1-S268的功能研究.pdf

摘 要 光系统 II 高分辨率晶体结构从原子水平上揭示了包括 Mn CaO 簇在内的蛋白 4 5 复合体的结构，特别是一些重要的氨基酸它们可能在光合水氧化过程中有着重要的 调控作用。其中 D1 蛋白中 D1-N338 和 D1-S268 分别是供体侧锰簇和受体侧非血素 铁的周围氢键网络上的重要氨基酸残基，很可能参与光合水氧化过程中质子的转运。 为了研究它们在水氧化过程中的功能，本文以嗜热蓝藻 Thermosynechococcus vulcanus 为研究材料，以 D1-N338 位点和 D1-S268 位点为主要研究对象，采用定 点突变的方法，构建了多个嗜热蓝藻位点突变体，并运用波谱学、氧电极、叶绿素 荧光衰减动力学等手段对突变体功能进行了深入研究，揭示了这些氨基酸可能对维 持正常的光合水氧化功能具有重要意义（嗜热蓝藻野生型含有 3 个同源基因同时编 码 D1 蛋白，分别是psbA 1 、psbA 2 、psbA 3 。实验中我们选择敲除 psbA 1 和 psbA 2 基 r 因，获得 WT*(psbA –Sm ) ，在以下论文简称为 WT* ，之后在 psbA 基因上定点突 3 3 变获得实验的各种突变体）。 主要研究结果如下： （1）通过定点突变技术，成功获得 D1-N338E 、D1-N338F 、D1-N338L 、D1-S268H 、 D1-S268N 和 D1-S268T 等 6 个嗜热蓝藻突变体。 （2 ）测定了突变体的光合自养生长状况：在 40 μmol m-2 s-1 光强下，突变体 D1-N338F 、D1-N338E 、D1-N338L 、D1-S268H 及 D1-S268N 细胞光合自养生长速度 与野生型对照 WT*相比基本相同，而突变体 D1-S268H 、D1-S268T 细胞光合自养生 长速度较 WT* 的略低。 （3 ）测定了 D1-N338 和 D1-S268 突变体细胞的放氧活性，在 pH = 6.5 时， D1-N338E 、D1-N338F 、D1-N338L 的放氧活性分别是 WT* 的 98% 、91%、88%左 右，D1-S268H 、D1-S268N 、D1-S268T 的放氧活性分别是 WT* 的 92%、73%、76% 左右，表明 D1-N338 位点对维持细胞正常放氧活性影响较低，而 D1-S268 相关突变 相对细胞放氧活性影响较大。 （4 ）通过室温吸收光谱实验和 77 K 低温荧光光谱实验，发现了突变体 D1-N338F 与其他细胞在藻胆体能量传递方面有较大影响。 （5 ）在DCMU 不存在和 DCMU 存在两种情况下，分别开展了 D1-N338 位点和 D1-S268 位点突变体 QA-再氧化的叶绿素荧光衰减动力学研究，结果表明所有突变体 PSII 受体侧的电子传递与野生对照相比没有受到改变。在给体侧电子传递方面， D1-S268 突变体与野生对照相似，而 D1-N338F 和 D1-N338L 位点突变一定程度改变 了PSII 供体侧的电子传递。 I （6 ）对经过定点突变后的功能实验筛选出三个较野生型有显著差异的突变体， 通过提取其类囊体膜，粗 PSII ，PSII 核心，分别测定其放氧活性和进行 SDS 电泳实验，发现经过突变后的光系统核心PSII 活性较野生型差异甚大。 综上所述，D1-N338 位点和 D1-S268 的突变分别影响了放氧活性，表明该位点 对维持正常光合放氧功能是非常重要的，位点突变而导致的功能改变很可能是由于 改变了 PSII 给体侧或者受体侧的氢键网络结构。 关键词 光系统 II ；定点突变；放氧活性；氢键网络；电子传递