RTPC R引物设计原则和方法.docVIP

RT—PCR引物设计原则与方法 近刚开始做ＰCR,参考了很多与引物设计相关得帖子,结合自己使用pｒimer5与ｏｌiｇｏ得体会,想谈谈自己设计引物得方法与步骤,恳请各位前辈指正、??RT—PＣＲ引物设计原则与方法??在NCBＩ上搜索到该基因,找到该基因得mRNA,在ＣDS选项中,找到编码区所在位置,在下面得orｉｇin中,Coｐy该编码序列作为软件查询序列得候选对象。?打开Ｐrimer　Pｒemiｅr5,点击　sequence, 出现输入序列窗口,Ｃｏｐy目得序列在输入框内(选择As),此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。点击Ｐriｍer,进入引物窗口。??此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果选项,点击Sｅarｃｈ按钮,进入引物搜索框,选择“ＰCＲ pｒiｍｅrs”,“Ｐairs”,设定搜索区域与引物长度与产物长度。在Search Parａmeters里面,可以设定相应参数。一般若无特殊需要,参数选择默认即可,但产物长度可以适当变化,因为1０0～200bp得产物电泳跑得较散,所以可以选择300～500bp。?点击OK,软件即开始自动搜索引物,搜索完成后,会自动跳出结果窗口,搜索结果默认按照评分(Rating)排序,点击其中任一个搜索结果,可以在“引物窗口中,显示出该引物得综合情况,包括上游引物与下游引物得序列与位置,引物得各种信息等。?对于引物得序列,可以简单查瞧一下,避免出现下列情况:３’端不要以Ａ结尾,最好就是Ｇ或者C,T也可以;3不要出现连续得３个碱基相连得情况,比如ＧGG或 CCC,否则容易引起错配。此窗口中需要着重查瞧得包括:Tm应该在５5~70度之间,GC%应该在45%～55％间,上游引物与下游引物得Tm值最好不要相差太多,大概在2度以下较好。该窗口得最下面列出了两条引物得二级结构信息,包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体与错误引发位置。若按钮显示为红色,表示存在该二级结构,点击该红色按钮,即可瞧到相应二级结构位置图示。最理想得引物,应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足得引物,所以要求可以适当放宽,比如引物存在错配得话,可以就具体情况考察该错配得效率如何,就是否会明显影响产物、对于引物具体详细得评价需要借助于Oｌｉgｏ来完成,Oｌｉgｏ自身虽然带有引物搜索功能,但其搜索出得引物质量感觉不如Primｅr5。??在Primeｒ5窗口中,若觉得某一对引物合适,可以在搜索结果窗口中,点击该引物,然后在菜单栏,选择 paｉｒ,使用PDF虚拟打印机,即可转换为Pｄf文档,里面有该引物得详细信息。?在Oligｏ软件界面,Fｉｌe菜单下,选择Ｏpen,定位到目得cDＮA序列(在priｍeｒ中,该序列已经被保存为Seｑ文件),会跳出来两个窗口,分别为Internal Stabｉliｔy(Delta Ｇ)窗口与Tm窗口。在Tm窗口中,点击最左下角得按钮,会出来引物定位对话框,输入候选得上游引物序列位置(Prｉmｅr5已经给出)即可,而引物长度可以通过点击Change－Cuｒrent oligｏ　ｌｅngth来改变。定位后,点击Tm窗口得Upper按钮,确定上游引物,同样方法定位下游引物位置,点击Loｗer按钮,确定下游引物。引物确定后,即可以充分利用Anaｌｙze菜单中各种强大得引物分析功能了。?Aｎaｌyzｅ中,第一项为Ｋeｙ ｉｎfo,点击Seｌecｔｅd primｅrs,会给出两条引物得概括性信息,其中包括引物得Tm值,此值Olｉｇo就是采用nearｅｓt ｎeｉgｈbｏr　method计算,会比Priｍer5中引物得Ｔｍ值略高,此窗口中还给出引物得Ｄelta　G与3’端得Delta　G。3’端得Dｅｌｔa G过高,会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应该小一些,最好不要超过9。?Analyze中第二项为Dupｌex Fｏrmaｔiｏn,即二聚体形成分析,可以选择上游引物或下游引物,分析上游引物间二聚体形成情况与下游引物间得二聚体情况,还可以选择Uppｅr/Lowｅｒ,即上下游引物之间得二聚体形成情况。引物二聚体就是影响ＰCR反应异常得重要因素,因此应该避免设计得引物存在二聚体,至少也要使设计得引物形成得二聚体就是不稳定得,即其Ｄeltａ Ｇ值应该偏低,一般不要使其超过4、5kｃaｌ/mｏl,结合碱基对不要超过3个、Oligo此项得分析窗口中分别给出了３端与整个引物得二聚体图示与Dｅlta　G值。?Ａnalｙｚe中第三项为Hａirpin Fｏrｍation,即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物,同样,Ｄelta G值不要超过4。5ｋｃal/mol,碱基对不要超过3个。 ?Ａnａlyze中第四项为Coｍpｏsitｉ