分子生物学-11-2-第五章蛋白质组学的研究方法.docVIP

PAGE 郜刚分子生物学教案 5.6蛋白质组学的研究方法和进展 随着2001年2月15日人类全基因组序列草图的完成，也宣告人类将由基因组计划进入后基本组时代。基因组时代的研究发现，在揭示基因组精细结构的同时，也显示出基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂性与多变性之间存在着巨大反差。这种反差的存在使人们认识到，要研究生命现象，仅仅研究基因组的结构是远远不够的，必须对生命活动的直接执行者一蛋白质的重要性有更深刻的了解，因此，一个以“蛋白质组”为研究重点的时代已悄然到来。 是指基因组表达的全部蛋白质，广义上讲，蛋白质组是指“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。 作为研究蛋白质组的三大核心技术之一，（另外两种分别是计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术）。 基因组与蛋白质组比较 1 同一性与多样性 2 有限与无限 3 静态与动态 4 时间与空间 5 孤立行为与相互作用 6 单一手段与多种技术 一、蛋白组学的概念 proteome “蛋白质组”一词的英文是PROTEOME，由PROTEins和genOME两个词组合而成， 这一概念是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994年提出的， 蛋白质组是： 对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 。 在空间和时间上动态变化着的整体。 蛋白质组学(proteomics) 蛋白质组学是蛋白质和基因组研究在形式和内容上的完美结合，是研究某一物种、给、器官、组织、细胞在特定调价、特定时间多表达的全部蛋白质图谱。 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 蛋白质组学主要研究内容 了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类； 明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的表达-互作网络的； 描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。 蛋白质组学的研究策略2/2 1、竭泽法涸泽而渔眉毛胡子一把抓 即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，即蛋白质的表达模式(Expression Profile)，这种观点从大规模、系统性的角度看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。 2、功能法某生理功能的动态研究 旨在研究不同状态细胞蛋白质组成、定位和修饰等的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达、差异定位和差异修饰，以发现有差异的蛋白质种类或者形式作为主要目标 功能蛋白质组学 （核心内容）(functional proteomics) 功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。 它是介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。 研究的策略是： 从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。然后将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱 蛋白组学的技术支撑体系 第一类是蛋白质组的分离技术。如双向凝胶电泳技术，细胞分级分离技术、亲和层析技术等。 第二类是蛋白质组的鉴定技术，其核心是质谱技术。 关键技术包括样品分离技术、2D（双向电泳）技术、质谱鉴定技术、X-射线晶体衍射、核磁共振等技术等 质谱鉴定技术面临的一个最大问题是，它要依赖于已知的蛋白质或基因的序列作为检测的基础，通过比较来确定待测定的蛋白质。对于在已有数据库中没有记载的全新蛋白质进行鉴定则非常困难，对于这种蛋白质，一般是利用经典的Edman降解法进行N端序列测定或C端化学降解法测定C端序列，即 “从头测定”(De Novo Identification)从而得到未知蛋白质的信息。 蛋白质组研究的试验方案 蛋白质组研究的技术流程 蛋白质组学设备 1 全过程分析仪器 2 第一维电泳（IEF）仪 3 第二维电泳: 4 MALDI-TOF 质谱仪、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱 5 LC-MS/MS（质谱仪） 6 自动化仪器 5.6.1 双向电泳技术 2D = IEF/SDS 1975年，O’Farrell等人根据不同组分之间的等电点差异和分子量差异为两种不同的分离原理，建立了IEF/SDS-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳的分离技术，简称IEF/SDS。 5.6.2 蛋白质印迹法 Western bloting 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形