分子医学技能：E玫瑰花环形成实验.pptVIP

E玫瑰花环形成实验 E Rosette Forming Cell Test 掌握E花环形成的原理 熟悉E花环形成实验的步骤及光镜下E 花环的形态 熟悉磁珠分离的原理 实验目的 T细胞的表面分子是T细胞与其它细胞和分子间相互识别及作用的物质基础。它们在T细胞活化、增殖和分化等过程中起重要作用。 TCR-CD3复合物参与T细胞的抗原识别和信号转导； CD2、CD28、CTLA-4、CD45、CD40L 等膜蛋白参与T细胞活化及T细胞与其它细胞间相互作用。 CD4/CD8分子辅助TCR识别结合抗原，参与信号转导；根据CD4和CD8分子的表达将其分为CD4+T和CD8+T细胞。 T细胞 CD2 CD3 TCR CD8 密度梯度离心法 CD4 T细胞表面分子 依靠表面标记的分离方法 流式细胞术分离法：利用各种荧光素标记的表面标记特异性抗体，使不同表面标记的细胞结合上不同的荧光素，借助荧光活化细胞分选仪将各种细胞分离开来。 * * 免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。 磁珠(microbead) 标记细胞上的磁珠在扫描电镜下也几乎看不到 磁珠分离策略： 一. 阳性分选 磁珠标记目的细胞 未标记细胞先行流出 移出磁场后收集目的细胞 CD4+T细胞 分离柱 CD4-T细胞 磁珠标记非目的细胞 目的细胞先行流出 二. 阴性分选 成熟的人T细胞表面表达绵羊红细胞（SRBC）受体（即CD2分子），能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，可在光学显微镜下观察计数。本法可用于分离外周血T细胞及检测T细胞的数量和比例。 E花环分离法原理 * T T B SRBC CD2 实验材料 1.肝素抗凝血 2.Hank’s液 3.淋巴细胞分离液 4.绵羊红细胞悬液 5.灭活小牛血清 6.水平离心机、37℃温箱、显微镜等 实验方案 取外周血 绵羊红细胞 淋巴细胞 分离 显微镜下观察 + 实验步骤 淋巴细胞的分离 用Hank’s液配成106细胞/0.1ml 加等量灭活小牛血清(0.1ml) 取0.1ml 加入0.5％绵羊红细胞0.2ml 混匀，37℃温箱放置5分钟 1000rpm离心5min 加1小滴1％美蓝，用毛细吸管轻轻混匀 取1滴于玻片上，加上盖玻片 高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞 置4℃冰箱 5min 30-45min 结果判断 凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成阳性细胞。 正常人的花环形成率50-70%，大致可以代表周围血中T细胞的百分数。 左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞； 右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。 T淋巴细胞玫瑰花环 T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500× 测定外周血中的T细胞数，观察受检者的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效。 观察免疫抑制剂的效果，协助进行恶性肿瘤疗效的观察及预后判断等。 临床应用 注意事项 1. 实验血液新鲜分离:是为了保证淋巴细胞 的活性,不影响E玫瑰花环形成率。 2. 绵羊红细胞要新鲜,采用无菌脱纤维羊血。 Thanks!