分子医学技能：实验二DNA的电泳检测法 PCR检测乙肝病毒PCR分析apoB基因多态性.pptVIP

1、待测血清中DNA简单制备 待测血清40ml + 40ml DNA 提取液，混匀 ? 沸水浴10min，10000rpm×5min 上清 样品模板（用做检测） 无菌水40ml + 40ml DNA 提取液 ? 沸水浴10min，10000rpm×5min 上清 空白模板（做阴性反应） 实验分组 全班5个小组（2人）为一大组（9-10人），每组包括： 阳性反应1个 阴性反应1个 样品检测反应3个 阳性模板2ul 空白模板2ul 样品模板2ul 混匀， 6000rpm×5s，上PCR仪 93℃×3min 预变性 ? 94℃，30s 55℃，30s 72℃，30s ? 72℃保温5min 30个循环 PCR反应程序： 三、PCR检测人apoB基因多态性分析 PCR实验操作及注意事项 实验目的及预期结果 目的： 检测来自不同样本的基因多样性 检测技术：apoB基因的PCR 预期结果： 琼脂糖电泳条带的差异 apoB多态性分析的基本实验过程 来源不同的待测样本 PCR扩增目的基因 琼脂糖电泳结果比较分析 反应体系 Mix 12.5 ul 引物 2 ul ddH2O 2.5 ul DNA模板 8 ul 实验主要步骤 apoB基因 PCR，2人一组，每组1份 分装PCR反应液每份21ul （包括：Taq，引物一对，反应缓冲液，dNTP） 加入模板4ul（口腔细胞总DNA） 混匀，离心 上PCR仪 PCR程序： 94℃? 5min（预变性） 94℃? 1min（变性） 60℃? 4min （退火+延伸） 60℃? 5min（续延伸） 30个循环 Thank you! 2011年3月 HBV-PCR反应结果预测 袁洁 yuanjie@mail.sysu.edu.cn 实验二 DNA的电泳检测法 PCR检测乙肝病毒PCR分析apoB基因多态性 乙肝病毒PCR实验操作 apoB基因PCR多态性分析 血清样本处理 （模板的制备） PCR检测乙肝病毒 PCR反应上机 口腔细胞总DNA电泳 （模板的检测） apoB基因PCR实验操作 PCR反应上机 实验安排 （2人一组，1份乙肝病毒PCR，1份apoB基因PCR） 琼脂糖凝胶板的制备 （封板、梳子位置与高度、凝固后拔梳）  倒缓冲液 （样品中加入1/5体积的上样buffer） 加样，电泳（方向、电压、时间）  染色与检测 （已在胶中加入染料，紫外下检测） 电泳实验的步骤及注意事项 电泳基本原理及相关知识 DNA琼脂糖凝胶电泳 ? 电泳的概念 带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定 ? 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类） ? 纸电泳 ? 醋酸纤维膜电泳 ? 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ? 电泳的基本原理 利用物质的两个差异来分离物质 电荷差异 电荷性质 电荷数量 分子差异 分子大小 分子形状 ? 电泳的影响因素 ? 带电粒子的性质 ? 电场强度 ? 溶液的pH ? 溶液的离子强度 ? 电渗现象 ? 环境因素 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带上负电荷，在电场中向正极方向泳动 因为各种DNA分子的电荷数、构象、分子量不同，它们在通过凝胶立体网络是所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，达到分离的目的 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光 EB的替代染料：SYBR GREEN，GOLDVIEW DNA琼脂糖基本原理 点样孔 细菌基因组DNA OC 型质粒DNA LC型质粒DNA SC 质粒DNA 细菌RNA 实验结果的分析 PCR基本原理及相关知识 The Polymerase Chain Reaction Sometimes called mol