复合bFGF缓释微球的制备与性能测定.docxVIP

复合bFGF缓释微球的制备与性能测 定 【摘要】 目的：制备复合碱性成纤维 细胞生长因子的可降解缓释微球，考察其各 项性能，为进一步应用于组织工程奠定基础 方法：采用改良的乳化冷凝法交联制备复合 bFGF的缓释微球，测定微球形态、粒径、载 药率和包裹率等，并采用ELISA法考察其体 外bFGF的缓释效能.结果：缓释微球平均 粒径（±）从g平均载药率为％平均包裹 率为%. d 1体外释放％ 2~5 d时累积释放 率达到%, d 7时释放减慢且累计浓度为 %. 结论：复合bFGF的缓释微球制备工艺简便， 性能优良；可在较长时间内持续释放活性 bFGF与组织工程支架的结合应用具有可行 性. 【关键词】碱性成纤维细胞生长因子； 微球；缓释；包裹率 0引言 生长因子的应用一直是组织工程领域 的重要课题之一.它具有多种生物学活性， 可提供有利于细胞生长的微环境，促进新生 组织血管生成等:1:.但由于生长因子半 衰期短，溶液进入体内后迅速扩散、变性或 酶解，难以保持其生物活性:2].我们制 备复合碱性成纤维细胞生长因子 （basic fibroblast growth factor , bFGF）的缓释 微球载体，并考察微球形态、粒径、载药率、 包裹率及释放效果等性能，以期利用此种新 型载体在较长时期内持续释放 bFGF为今后 与组织工程支架的结合应用奠定基础 . 1材料和方法1材料 明胶（等电点50,相对分子量99 000 , 华美生物工程公司），人重组bFGF溶液（25 mg/L,等电点，Sigma公司），人bFGF定量 EIA试剂盒，250 g/L戊二醛，丙酮，异丙 醇，无水乙醍，液体石蜡，氨基乙酸为国产 分析纯，Span80（Sigma公司）为进E1分析纯， 水为双蒸水，JJ1型精确电子搅拌器仪， TGL16南速离心机，GENESI院干机（Virtis 公司），BX41数码显微镜X 100%.包裹率 =x 100%.取缓释微球（2 mg），用PBS缓冲 液100 mL作为溶出介质.药物体外溶出仪 的温度保持在(土)C .磁力搅拌转速 100 r /min.分别于各时间点(1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 d)取样100 L.每次取样后，立即补充 同温度的PBS缓冲液100 p L.按1~7 d顺 序，将稀释10倍的样品，分别加入微孔板7 个孔中，每孔加样50 ^L并同时加入样品 稀释液各50 fl L.将反应板充分混匀后置 37C 120 min.用洗涤液将反应板充分洗涤 4~6次，向滤纸上印干.每孔加入第一抗体 工作液50(1 L,将反应板置37C 60 min.洗 板，并在每孔中加入酶标抗体工作液 100 11 L. 将反应板放置于37 C 60 min.洗板后加入 底物工作液100(1 L,置37C暗处反应10 min. 每孔中加入一滴终止液，混匀.在A492 nm 处测各孔值.根据A值在标准曲线上查出相 应bFGF含量. 2结果 缓释微球的形态和粒径空白缓释微球 呈圆球状，形态及粒径大小较均匀；复合有 bFGF的缓释微球经溶涨体积变大，形态饱满 (Fig 1B). 微球粒径 7~20 ( 土 ) p m 占 ％. 标准曲线在492 nm处测各孔A值，由 此绘制标准曲线并拟合线性回归方程为： A=+, r= , bFGF在 0~500 ng/L 范围内符合 线性关系. 缓释微球中bFGF的含量在492 nm处测 定得A值，根据回归方程计算出相应 bFGF 含量.缓释微球中bFGF质量为g,由此 得出微球平均载药率为％平均包裹率为%. 缓释微球体外溶出度测定由缓释微球 体外释放样品各个时间点的 A值得出的bFGF 浓度，并由此绘制出微球体外累积释放量曲 线.A: Blank; B: bFGFimpregnated. 3讨论 bFGF是一类具有较高活性的多聚肽，对 多种中胚层和神经外胚层来源的细胞具有 广泛的生物学活性，可改变一些细胞的趋化 性，诱导或抑制特殊蛋白质的合成或分泌 [3].但由于这种多功能细胞因子半衰期 短，易失去活性，应用效果不甚理想.我们 设计的缓释微球可缓释药物、靶向输送、保 证药物的治疗作用的前提下减少给药剂量 以及降低药物毒性等[4].通过含量测定， 缓释微球对bFGF的包裹率可达%.体外证实, 复合bFGF缓释微球在7 d内对上皮细胞仍 有促进增殖活性:5] . bFGF的累积释放量 呈缓慢上升趋势，d 1累积释放率为％不 存在初始阶段的“突释”现象 [6]; 2~5 d, 累积释放量率％，克服了部分同类产品释放 药物时初期浓度过大， 短期内又迅速降低现 象;到7 d时，累积释放率达到 % 虽然释放 速率减慢，但体外仍有 bFGF生物活性. 本实验对缓释载体的研制尚处于实验 室阶段，但由于此种缓