Western_Blotting免疫印迹(试剂配制--每步操作详解--WB常见问题分析--分离范围)[汇编].pdfVIP

Western （试剂配制和操作步骤） 试剂配制：（一）母液 （二）使用液 操作步骤：（一） 蛋白样品制备 （二）蛋白含量的测定 （三）SDS－PAGE 电泳 （四）转膜 （五）免疫反应 （六）化学发光，显影，定影 （七）凝胶图象分析 关键词：印迹试剂 Western 印迹法 免疫反应 蛋白样品制备 SDS－PAGE 电泳 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序 列的特异性试剂作为探针检测之。 Western 使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的 靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的 复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 耗材： 硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（20×20cm），X-光片夹，X-光片， 玻棒长短各一根，计时器，吸水纸， 试剂配制： （一）母液 1.0mol/L Tris•HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至 250ml，高温灭菌后室温下保存 。 PH HCl 7.4 约 17ml 7.5 约 16m 7.6 约 15ml 8.0 约 10ml 10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10％过硫酸胺（AP ） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，4 ℃保存，保存时间为 1 周。 1.5mol/L Tris•HCl （pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至 8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 0.5mol/L Tris•HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至 6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 20 ％Tween20 Tween20 20ml 蒸馏水至 100ml 混匀后 4 ℃保存。 （二）使用液 单去污剂裂解液 （50mmol/L Tris•HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX －100，100?g/ml PMSF） ： 1mol/L Tris•HCl （pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX －100 0.5ml 蒸馏水至 50ml 混匀后， 4 ℃保存。使用时，加入 PMSF 至终浓度为 100?g/ml （0.87ml 裂解液加入 1.74 mg/ml PMSF50μl）。 0.01mol/L PBS （pH 7.2-7.4） NaCl 8.0g KCl 0.2g Na HPO 1.44g (Na HPO .H O 1.56g \ Na HPO .12H O 3.58g) 2 4 2 4 2 2 4 2 KH PO 0.2g 2 4 蒸馏水至 1000ml G250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考