矮型鸡于正常型鸡的miRNA表达谱分析精品.docxVIP

1刖言 在现代社会，肥胖、U型糖尿病问题已经成为了一个公共性的健康疾病，越来越多 的引起了人们的关注。它们的病理过程涉及脂类代谢和脂肪形成，深入理解脂肪形成的 分子机制，对解决这些疾病的防治问题具有重要意义。 一直以来，脂肪组织被认为是带有一些优良特性且能储存能量的惰性组织，例如它 可做为绝缘物质以及机械性地支撑更重要的结构。 1994年瘦素的发现，预示着人们逐渐 意识到脂肪细胞是整个身体能量平衡的必要调节剂。这些细胞分泌一些蛋白，它们的调 节过程因体内平衡、血压、免疫功能、血管形成以及能量平衡状态的不同而不同 (To ng, 20XX; Farmer, 20XX; Rosen, 20XX)。脂肪细胞来源于多能间充质干细胞。脂肪生成为两 个阶段。第一是定型，这是分化特征出现前确定分化方向的过程，多功能间充质干细胞 分化成前体脂肪细胞，失去了向其他方向细胞分化的能力，但是在形态学上与先前细胞 不能区分开；第二是终端分化，细胞具有了成熟脂肪细胞的特性：脂质的转移和合成， 对胰岛素的敏感性以及脂肪细胞特殊蛋白的分泌。 MicroRNA(miRNA)是一类大小约18?25nt的内源性非编码小RNA分子，具有高度 保守性，其本身不具有开放阅读框(open Reading Frame, ORF)是一组不编码蛋白质的短 序列RNA，是一种广泛存在的对基因表达进行调控的分子。 miRNA广泛存在于真核生 物中，其序列和功能在不同物种间非常保守。1993年丄ee等(1993)在秀丽新小杆线虫 (cae no rhabditis elega n中发现了第一个定时调控胚胎后期发育的基因 lin-4。此后,研究者又 在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7。20XX年10月 《Scienee〉报道了 研究者从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似 C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为 microRNA (miRNA )。随后多个研究小组在包括动物、果蝇、植物、病毒等多种生物物 种中鉴别出上千个 miRNAs。从MicroRNAs被发现至今，人们对MicroRNAs研究的热情 一直剧增。人们发现MicroRNAs在许多生物过程中都具有调节作用，包括调节发育、细 胞增殖、分化，凋亡以及脂肪细胞分化。 研究表明，miRNA不但调控动物脂肪细胞的分化， 还参与脂类代谢及与脂类代谢 相关的激素内分泌调节，有的甚至与肥胖、U型糖尿病等脂类代谢病的基本病理相关(Poy M N，20XX ; Takanabe R, 20XX )。Esau C 等(20XX )研究发现 miR -122 直接调节体 内脂类代谢，将miR -122的反义寡核苷酸投予小鼠可增加肝脏脂肪酸氧化作用， 同时降 低脂肪酸合成；删除miR -14导致动物甘油三酯和甘油二酯水平增加(Xu P , 20XX); 这些研究事实表明，通过miRNAs功能的研究，可以加深对脂肪形成和脂类代谢性疾 病的病理生理过程的分子机制了解，并将miRNAs作为这些代谢性疾病治疗的潜在靶点。 目前，虽然对miRNAs调节动物脂肪细胞分化和脂类代谢的了解还不多， 但miRNAs 自身的调节特点及其潜在应用价值，使其必将成为未来几年该领域的研究热点。并且， miRNA作为小调控RNA,研究其对脂肪细胞分化的调节作用，可以从一个新的角度了解脂 肪组织的生长发育机理。 本研究以7周龄GHR缺失型矮小型鸡为研究对象，以正常型鸡为参照，采用微阵列 基因芯片技术检测矮小型鸡(dw-)和正常型鸡(normal)腹脂中的miRNA表达情况， 分析miRNA的表达谱，找出差异表达的 miRNA,为进一步筛选出与脂肪生成相关的 miRNA,并探讨其在脂肪生成过程中的作用机制提供依据。 2材料与方法 2.1实验动物 实验动物来自于南海种禽有限公司。2个品种均为隐性白羽洛克鸡。其中一个以隐性 白羽洛克鸡为基础，通过导入矮小型基因(dw)并经多个世代的选育，形成了遗传性能 稳定的矮小型隐性白羽洛克鸡，简称矮小型鸡(Dwarf chicken)；另一个为体型正常的隐 性白羽洛克鸡，简称正常型鸡(Normal chicke n)。 2.2主要试剂及仪器 固相RNA酶清除剂购于天根有限公司；北京六一电泳仪DYY-CC 型;苏州SW-CJ-1 Cu型双人单面净化工作台； 2.3样本的采集 随机抽取按常规饲养方法饲养至 7周龄的矮小型鸡和正常型鸡各 9只，用经DEPC 水处理过的器械分离出腹脂，分别装入冻存管中，迅速置于液氮( -196C )中保存； 2.4用于microRNA表达谱分析的样品总RNA制备 矮小型鸡与正常型鸡腹脂的总 RNA的抽提按照常规的Trizol提取方法进行。总RNA 的提取采用In vitroge n公司的T