(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验.docVIP

蛋白免疫印迹（ western blot ）实验 实验步骤 ： 一、试剂准备 SDS试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 匀浆缓冲液： 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml ；10%SDS6.0 ml；β - 巯基乙醇 0.2 ml； ddH2O 2.8 ml 。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g ； Tris 5.8 g ； SDS 0.37 g ；甲醇 200 ml ；加 ddH2O定容 至 1000 ml 。 4. 0.01 M PBS(pH7.4) ： NaCl 8.0 g ；KCl 0.2 g ； Na2HPO4 1.44 g ；KH2PO4 0.24 g ；加 ddH2O至 1000 ml 。 5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g ；甲醇 80 ml ；乙酸 2 ml ； ddH2O118 ml。包被液（ 5% 脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉 1.0 g 溶于 20 ml 的 0.01 M PBS 中。 6. 显色液： DAB 6.0 mg； 0.01 M PBS 10.0 ml ；硫酸镍胺 0.1 ml ；H202 1.0 μl 。【晶莱生物】 二、蛋白样品制备 单层贴壁细胞总蛋白的提取 1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加 3 ml 4 ℃预冷的 PBS（ 0.01M pH7.2 ～ 7.3 ）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。 重复以上操作两次， 共洗细胞三次以洗去培养液。 将 PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按 1ml 裂解液加 10 μl PMSF（ 100 mM），摇匀置于冰上。（ PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加 400 μl 含 PMSF的裂解液，于冰上裂解 30 min ，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6）于 4℃下 12000 rpm 离心 5 min 。（提前开离心机预冷） （7）将离心后的上清分装转移倒 0.5 ml 的离心管中放于－ 20℃保存。 组织中总蛋白的提取 1）将少量组织块置于 1～ 2 ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2） 加 400 μL 单去污剂裂解液裂（含 PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 （4） 裂解 30 min 后，即可用移液器将裂解液移至 1.5 ml 离心管中，然后在 4℃下 12000 rpm 离心 5 min ，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于－ 20℃保存。 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取 由于受药物的影响， 一些细胞脱落下来， 所以除按 1 操作外还应收集培养液中的细胞。 以下是培养液中细胞总蛋白的提取： （1）将培养液倒至 15 ml 离心管中，于 2500 rpm 离心 5 min 。 （2）弃上清，加入 4 ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤，然后 2500 rpm 离心 5 min 。弃上清后用 PBS重复洗涤一次。 3）用枪洗干上清后，加 100 μL裂解液（含 PMSF）冰上裂解 30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm 离心 5 min，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于－ 20℃保存。 三、 蛋白含量的测定 制作标准曲线 （1）从－ 20℃取出 1 mg/ml BSA ，室温融化后，备用。 （2）取 18 个 1.5 ml 离心管， 3 个一组，分别标记为 0 mg，2.5 mg，5.0 mg， 10.0 mg，20.0 mg， 40.0 mg 。 （3）按下表在各管中加入各种试剂。 （4） 混匀后，室温放置 2 min 。在生物分光光度计（ Bio-Photometer ， Eppendorf ）上比色分析。 检测样品蛋白含量 （1）取足量的 1.5 ml 离心管，每管加入 4℃储存的考马斯亮蓝溶液 1 ml。室温放置 30 min 后即可用于测蛋白。 （2） 取一管考马斯亮蓝加 0.15 mol/L NaCl 溶液 100 ml ，混匀放置 2 分钟可做为空白样 品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按 blank 测空白样品。 （3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯 2 次（每次 0.5 mL ），再用无菌水洗一次。 （4）取一管考马斯亮蓝加 95 ml 0.