冰冻切片步骤 很全面[整理].pdfVIP

冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际 上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片 前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。 同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合 于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法 应用在临床诊断。 1. 取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2. 速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需 要， 一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短 降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是 将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm ），如组织块小 可适量加OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液 氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持 原位切勿浸入液氮中，大约10-20s 组织即迅速冰结成块。在制成冻 块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝 箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3 ．固定： 样品托上涂一层OCT 包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱 预冷5-10min 让OCT 胶浸透组织。 取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT 胶，以完全覆盖为宜， 速冻架（PE ）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片 机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续 切薄片至5-10μm 。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温 度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织 切片，切勿上下移动。切好室温放置30min 后，入4 ℃丙酮固定 5~10min，烘箱干燥20min 。PBS 洗5min×3 。进行抗原热修复，微 波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2 孵育5~10min，消除 内源性过氧化物酶的活性。 5 ．免疫荧光染色： 冰冻切片室温晾干15min,可用含10％正常山羊血清的PBS 室 温封闭切片1 小时（此步可不洗） 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而 定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干 涸)，将切片放在加了PBS 的免疫组化湿盒，室温孵育2 小时或4 ℃ 过夜。 第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回 收，将切片插入到小染缸PBS 冲洗。 滴加用PBS 稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育 1 小时。 回收二抗，切片置于染缸内，PBS 洗5min×3 次。 滴加DAPI 工作液染核，室温10-20min(工作浓度0.1%染色 15min)。 回收DAPI,滴加5-10μl 抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理 干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍 照。做好的片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。