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狂犬病病毒培养技术的研究进展 狂犬病作为一种几乎 100%致死的人兽共患传染病，对人类的危害已经存在了 4000 多 年，至今仍无有效的治疗药物，可行的控制策略只有暴露前免疫和暴露后预防。其中暴露前 免疫主要是针对动物而言，因为人的狂犬病来源于动物，只要动物的狂犬病免疫预防有效， 可完全控制人狂犬病的发生；而暴露后预防主要用于人，因为人一旦被带毒动物咬伤，必须 及时进行全程的暴露后预防才能防止感染狂犬病病毒。 不论是暴露前免疫，还是暴露后预防，都离不开安全、有效、廉价的疫苗。人和兽用狂 犬病疫苗的发展，都依赖于病毒培养技术的不断进步，尤其是微载体、发酵技术和无血清培 养基的广泛应用，把狂犬病病毒的增殖滴度提高到了一个新的水平，同时降低了生产成本， 从而使高质量的细胞纯化疫苗逐渐占领市场。 无论是传统的体内培养技术，还是现在的细胞培养技术，以及新型的细胞发酵和生物反 应器，目前都广泛应用于狂犬病病毒的实验室研究或疫苗生产。本文主要就狂犬病病毒培养 技术的发展和新技术的应用现状综述如下。 1 体内培养技术 体内培养技术利用了狂犬病病毒的嗜神经特性，具有敏感性好的优点，可以提高病毒检 测的阳性率，而且易于操作，适用于不具备组织培养条件的实验室。其中，小鼠脑内接种是 实验室最常用的狂犬病诊断和病毒培养技术之一，其他动物如大鼠、羊、兔等，过去主要用 于狂犬病神经组织疫苗的生产。 禽胚胎培养技术主要是利用鸭胚和鸡胚进行狂犬病病毒培养，如鸡胚传代致弱的 Flury-HEP、Flury-LEP 和 Kelev 毒株。 1.1 脑内培养技术 小鼠脑内接种是最常用的狂犬病病毒脑内培养技术，最早用于狂犬病野毒株的分离培养 是在 1925 年[5]。1955 年，该技术开始用于疫苗生产，Fuenjalida 和 Palacios 用新生鼠脑制 备出人用组织疫苗（SMBV），该疫苗曾在南美洲使用了40 多年，最终因使用后会引起严重 的神经综合症而被迫停产[1]，但是小鼠脑内接种技术却一直延用至今。目前，该技术已成 为病毒分离、毒力测定及中和试验等的常用方法，所用动物一般为小鼠，乳鼠对狂犬病病毒 脑内接种的敏感性高于幼鼠和成年鼠[6]。小鼠中，以瑞士白化鼠（Swiss albino）为首先 品种，该品种小鼠在实验室饲养容易，对狂犬病病毒高度敏感，但迄今尚未发现任何对狂犬 病病毒具有遗传抗性的小鼠品系，因此也可使用其他品种的小鼠。实验室一般不采用野生灰 鼠或家鼠，因为其野性较大，人工饲养困难。狂犬病脑内接种试验周期长，通常需观察21 天，且成本较高，操作技术性强，鉴于此，有的实验室已改用细胞（如小鼠成神经瘤细胞和 BHK 细胞等）代替小鼠进行试验。 其他脑内培养技术（大鼠、羊、兔等动物的脑内培养技术）在 20 世纪 80 年代以前曾广 泛应用于人狂犬病脑组织灭活疫苗的生产，如 Semple、Fermi 和 Hempt 疫苗等。但是，随着 细胞疫苗的发展和神经组织疫苗的使用安全问题，该技术已不再常用。 1.2 禽胚胎培养技术 7 －10 鸭胚培养技术过去主要用于人用狂犬病疫苗的生产，目前在实验室使用较少。1955 年， Peck 等开始研制狂犬病鸭胚疫苗，该疫苗于 1957 年在美国上市，到 1973 年已成为美国主 要的狂犬病疫苗，但是进入 80 年代后，在疫苗生产中人二倍体细胞（HDC ）培养取代了鸭 胚培养技术。 在狂犬病病毒适应鸡胚培养的研究发现，连续传 40～50 代时，获得的低胚传代株 （Flury-LEP）对小鼠、大鼠和仓鼠进行脑内或肌肉接种时仍具有致病性，豚鼠脑内接种也 可感染，但肌肉接种时则无致病力；家兔脑内和肌肉注射均不发病；犬肌肉接种也不发病。 但是，病毒在传代 176 至 182 代时（Flury-HEP）大部分毒力会丧失，此时将病毒脑内接种 成年鼠、兔、犬时，均无致病性。因此，一般高代次的 Flury-HEP 推荐在牛和猫中使用， Flury-LEP 仅用于犬。Kelev 株鸡胚疫苗系经鸡胚传代 60～70 次的病毒，该病毒对仓鼠、豚 鼠和兔的脑内和肌肉的接种均不产生感染症状；以高浓度的病毒对犬进行肌肉接种，也不出 现感染症状。Flury 和 Kelev 株均适于在鸡胚中生长，过去一直用于犬狂犬病疫苗的生产， 其中 Flury 株在世界范围内广泛使用。 鸭胚和鸡胚的接种基本一致，选取培养 7 天的健康胚，将狂犬病病毒毒液接种到卵黄囊 内，鸭胚培养 10～14d，鸡胚培养 9～10d。 2. 体外培养技术