显微镜的使用和细菌的简单染色-浙江工业大学首页.pptVIP

Exercise one 显微镜的使用和细菌的简 单染色 制作者：黄海婵（ hhc@zjut.edu.cn ） Tel :0571or 0571 实 验 内 容 显微镜介绍 油镜的使用原理 染色原理 目的要求 实验原理 实验材料 实验程序 作业 显微镜的使用 细菌简单染色的流程 实验原理 —— 显微镜介绍 ? 普通光学显微镜 (NIKON) ? 欧林巴斯（ OLYMPUS ）生物显微镜 ? 麦克奥林生物显微镜 显 微 镜 的 构 造 机械装置 光学系统 镜座 载物台 镜臂 标本夹和标本移动尺 粗调螺旋和细调螺旋 聚光镜升降螺旋 接目镜 接物镜及镜头转换器 聚光镜 虹彩光圈 反光镜 显微镜的放大倍数和分辨率 ? 1. 放大倍数 = 接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为： D= λ/2n·sin(α/2 ) 式中 D ：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ? ： 可见光的波长（平均 0.55 ? m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ? ： 镜口角（即入射角）。 实验原理 － 油镜使用的原理 ? 油镜，即油浸接物镜。当 光线由反光镜通过玻片与 镜头之间的空气时，由于 空气与玻片的密度不同， 使光线受到曲折，发生散 射，降低了视野的照明度。 若中间的介质是一层油 （ 其折射率与玻片的相 近 ），则几乎不发生折射， 增加了视野的进光量，从 而使物象更加清晰。 油浸没物镜 介质：左－空气；右－香柏油 实验原理 － 染色剂和染色原理 回目录页 ? 由于微生物细胞含有大量水分（一般在 80-90% 以上），对 光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有 明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性 和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后， 才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完 美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微 生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生 活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。 ? 微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而 进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、 渗透、吸附作用等。 化学因素如：正负离子之间的相互吸 引等。 实验原理 － 染色剂和染色原理 ? 染色剂 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料： 如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。 2. 碱性染料： 一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶 紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。 3. 中性（复合）染料： 如伊红、美兰等， Wright 染料和 Gimsa 染料等（常用于细胞核染色）。 4. 单纯染色： 这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物， 不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（ Sudan b) 的染料。 ? 细菌的等电点较低， pH 值大约在 2 — 5 之间，故在中性、碱性 或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电 离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性 染料进行结合。所以，在细菌学上常用 碱性染料 进行染色。 实验原理 － 染色剂和染色原理 微生物染色常用染料如下表： 实验原理 － 细菌的三种基本形态 球菌 （ Spherical coccus ） : 包括双球菌、链球菌、葡萄球菌、四 链球菌、八叠球菌等 杆菌 ( Rod-shaped bacillus ) ： 短小、粗大、细长、棒状、分支 螺旋菌 ( Spired-shaped spirallum ) ： 弧菌、螺菌 实验材料 ? 器材 ： 显微镜 、擦镜纸、吸水纸、载波片、盖玻片、接种 环、酒精灯、废液缸、洗瓶等。 ? 细菌形态的染色标本。 ? 菌种 ： 培养 12 — 18h 的枯草杆菌（ B.subtilis ) 、 大肠杆菌（ E.coli ）、 金黄色葡萄球菌（ S.aureus ） ? 染色液和试剂 ： 石炭酸复红、吕氏美蓝、香柏油、二甲 苯 ( 或者乙醇乙醚溶液）等 - 实验程序 － 显微镜的使用 ? 1. 用前检查 ：零件是否齐全，镜头是否清洁。 ? 2. 调节光亮度 ? 3. 低倍镜观察 ：粗调、细调 ? 4. 依次再进行 中倍、高倍观察 ? 5. 油镜观察 ：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标 本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清 物象为止。 ? 6. 换片 ：另换新片，必须从第三条开始操作。 ? 7. 用后复原 ：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的 油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲