临床色谱质谱检验技术：第六章 色谱质谱技术的其他常见应用（一）.ppt

方法 邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法 异硫氰酸苯酯 （PITC）法、 6-氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法 衍生方式 柱前 柱前 柱前 衍生化条件 30s 室温1h 55℃水浴10min 色谱柱 C18 C18 C18 检测器 激发波长340nm，发射波长450nm（伯胺），激发波长260nm，发射波长305nm（仲胺） 紫外检测器254nm 激发波长235nm，发射波长395nm 评价 线性范围广，可实现衍生化自动化 同时测定伯氨酸和仲氨酸；衍生物稳定；衍生化时间长，条件要求高 同时测定伯氨酸和仲氨酸；灵敏度高，但线性范围窄 衍生化高效液相色谱法 反应原理 ?OPA衍生化方法： 试剂不发荧光，不会干扰测定； 不能和仲氨酸（脯氨酸）反应； 与胱氨酸的衍生物产生的荧光 强度较低且不稳定。 ?FMOC衍生化方法： 能与仲氨酸反应； 衍生副产物干扰测定； 需用戊烷将反应多余的衍生化试剂萃取出 衍生化高效液相色谱法 OPA-FMOC（邻苯二甲醛-9-芴基甲氧基羰酰氯）法： 1、样品处理：取血浆样品1.00mL，加入4倍于样品体积的无水乙醇，在旋转混合器上充分混合，置4℃冰箱中30min，然后于0℃和15000r/min条件下离心20min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液用于氨基酸的分析； 2、柱前衍生：使用pH=10.5硼酸盐缓冲液加上OPA和FMOC，常温下衍生； 3、色谱条件：Hypersil ODS色谱柱，4.0×125mm，5μm； 流动相（A）：10mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4，pH=7.2缓冲液（PB），含0.5%四氢呋喃（THF）； 流动相（B）：PB-甲醇-乙腈（体积比50：35：15）； 流速：1.0mL/min；梯度洗脱；柱温40℃；检测波长：0min时，激发波长340nm，发射波长450nm，检测一级氨基酸（伯胺）的OPA衍生物；20.5min后，将波长切换至激发波长260nm，发射波长305nm，检测二级氨基酸（仲胺）的FMOC衍生物。 衍生化高效液相色谱法 PITC（异硫氰酸苯酯）法： 1、样品采集与处理：由前臂静脉取血1.0mL，血样取出后放置15min，以4000r/min离心10min，分离血清，置于-20℃冰箱中冷冻保存。血清样品在室温解冻后，取出200μL，加入乙腈400μL，涡旋30s，以12000r/min离心10min，取上清液移置另一试管中，于60℃下用氮气吹干溶剂，残留物加入100μL水复溶，备用。 2、柱前衍生：使用三乙胺乙腈溶液加上PITC和正己烷，常温1h衍生； 3、色谱条件：Shim-pack VP-ODS，4.6×250mm，5μm； 流动相（A）：甲醇-乙腈-水（体积比1：3：1）； 流动相（B）：0.1mol/L醋酸缓冲盐； 流速：1.0mL/min；梯度洗脱；柱温35℃。检测波长：254nm。 衍生化高效液相色谱法 AQC（6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯）法： 1、样品处理：从-80℃冰箱内取出样本后，在室温解冻，取出200μL，加入400μL乙腈萃取，涡旋30s，静置10min，4℃和12000r/min离心15min，取上清液置Ep管中，40℃氮气吹干，加水200μL复溶后，涡旋30s，备用。 2、柱前衍生：使用pH=8.8硼酸缓冲液加上AQC试剂，55℃水浴加热10min衍生； 3、色谱条件：Inertsil C18，4.6×250mm，5μm； 流动相（A）：甲醇-乙腈-水（体积比1：3：1）； 流动相（B）：0.1mol/L醋酸缓冲盐； 流速：1.0mL/min；梯度洗脱；柱温35℃；检测波长：激发波长235nm，发射波长395nm。 衍生化高效液相色谱法 《临床色谱质谱检验技术》 小结与思考 了解高效液相色谱技术应用于氨基酸检测 了解衍生化离子交换色谱法中，氨基酸与茚三酮反应原理 Thank You! 色谱法：利用混合物中各物质间在固定相和流动相间分配系数的差异，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。 色谱分配系数：在一定温度下，处于平衡状态时，被分离组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比。 * 检测器为：FID-氢火焰离子化检测器 * 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。当蛋白质这两个稳定因素受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等参数影响时蛋白质便容易凝集析出。 某一溶质溶解在两个互不相溶的液相中，若溶质在两相中的分子形态相同，在一定的温度下，两相接触达到平衡后，溶质在两相中的平衡浓度比值为一常数，且不随溶质浓度的变化而改变。 * 按Fischer投影式：羧基在上方，氨基在左侧的是L型，在右侧的是D