2-3 微生物学第二模块实验三 不同条件对产淀粉酶细菌产酶影响试验.pptVIP

试验三 不同营养和培养条件对淀粉酶产生菌生长的影响 一、实验目的 学习液体摇瓶培养技术； 了解不同营养成份和培养条件对微生物生长及酶活力的影响。 二、实验原理 微生物的培养/发酵方式： 二、实验原理 微生物的培养条件： 1、营养条件：碳源、氮源； 2、温度； 3、pH； 4、氧气； 5、渗透压等。 问题： 1、如何分析微生物的最适培养条件？ 2、产淀粉酶细菌的生长条件和产酶条件是否一致？ 二、实验原理 单因子变量法确定微生物的最适培养条件： 不同pH值 配方1：淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL，pH 4.0 配方2：淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL，pH 7.2 不同碳源 配方3：羧甲基纤维素钠 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL，pH 7.2 配方4：葡萄糖 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O， 1.5g，去离子水 1000mL，pH 7.2 不同氮源 配方5：硝酸钠 10g，淀粉 3g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL，pH 7.2 配方6：硫酸铵 10g，淀粉 3g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL，pH 7.2 二、实验原理 淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。 α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。 β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。 ?-淀粉酶 液化 β-淀粉酶 糖化 糊精、低聚糖 葡萄糖 淀粉 三、实验材料 菌种：实验二中分离获得的产淀粉酶细菌1株； 培养基：实验一中各组分别制备的各种摇瓶发酵培养基； 仪器：摇床、分光光度计。 四、实验步骤 (一)发酵液接种和扩培 提前24h将平板培养物刮取一环，在1mL无菌水中震荡打散，然后按50uL接种量分别转接如下六种10mL的液体摇瓶发酵培养基。（每组取一个菌种，接种6个不同的培养基） 在30℃、220rpm的培养箱里培养约24h。 1 pH4.0 2 pH7.2 3 碳源葡萄糖 4 碳源羧甲基纤维素 4 氮源硝酸钠 氮源硫酸铵 (二) 菌体生长量的测定 将培养24h后液体摇瓶培养物及对照培养基分别取出0.5mL于试管中，用玻璃移液管加入4.5mL蒸馏水，进行10倍稀释。 用对照培养基分别对分光光度计(600nm)进行校零。 将各稀释液分别倒入比色杯中，在分光光度计600nm波长下测定吸光值(OD600)。 如果菌液浓度过大，可继续稀释后再进行测量，保证OD值应控制在0.1-1之间。 分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600值大小，评价对菌体生长量的影响。 (三)不同培养条件对淀粉酶水解活性的测定 加入试剂 实验管（6） 对照管（6） 空白管（1） 1％的淀粉溶液 0.1mL 0.1mL -- 缓冲液 0.2mL 0.2mL 0.2mL 摇匀后40℃恒温水浴保温5min 相应发酵培养液 0.2mL -- -- 相应对照培养基 -- 0.2mL -- 蒸馏水 -- -- 0.3mL 摇匀后40℃保温15min 乙酸溶液 0.5mL 0.5mL 0.5mL 8000转离心5min 取0.5mL上清，加入0.5mL稀碘液试管中 加4mL蒸馏水稀释至5mL 计算淀粉酶酶活： 显色后，用空白管于660nm波长处校零，然后分别测定对照管和实验管的吸光度（A660）。计算各样品吸光度大小酶活力。 单位酶活（U/mL）的定义为：以1mL粗酶液在40℃，pH7.0条件下1min反应所引起的吸光度值变化0.1为1个酶活力单位。 比较各发酵菌液酶活力，判断哪种培养条件下酶活力最高。 发酵液体积 反应时间 稀释倍数 0.1A=1单位 1、每排负责一种培养基的调零： 第一排：pH4.0 第二排：pH7.2 第三排：碳源葡萄糖 第四排：碳源羧甲基纤维素 第五排：氮源硝酸钠 第六排：氮源硫酸铵 2、单数组负责生长量测定的调零，双数组负责酶活测定的调零。 先测生长量，再测酶活，调零后，确定班上每组同学都测定吸光光度值后再进行下一步实验！ 调零 五、实验记录 记录不同培养条件对产淀粉酶细菌生长和酶活的影响，分析该菌最适的培养条件和产淀粉酶条件： 培养条件 生长量 OD600 淀粉水解酶活性 A对照管 A实验管 单位酶活U/mL pH4.0 0.086 pH7.2