慢病毒载体包装构建过程[借鉴].pdfVIP

慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA 有效地整合到宿主染色体上，从而达到 持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细 胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。 对于一些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能 大大提高目的基因或目的shRNA 的转导效率，且目的基因或目的shRNA 整合到宿主细胞基 因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA 的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体 包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携 带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感 染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括： 慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有 的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒， 需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病 毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目 的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。 包装成分：由HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够 反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒 表达Gag 和Pol 蛋白，另一个质粒表达Env 蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可 能。将包装成分与载体成分的3 个质粒共转染细胞(如人肾293T 细胞)，即可在细胞上清中 收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1 载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV 顺式作用序列，同时 具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装 成分上5 ′LTR 换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3 ′LTR 换成SV40 polyA 等。 一、 实验流程（1 和2 为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD 酶，3K 内突变率为 0%)从模板中（CDNA 质粒或者文库）调取目的基因CDS 区（coding sequence ）连入T 载体。 将CDS 区从T 载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA 对应的DNA 颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素 抽提，共转染293T 细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24 和48h 后，分别收集富 含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。 二、实验材料 2.1 慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。 其中质粒上的ZsGreen1 表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP ）。 载体信息 1) 慢病毒克隆载体图谱如下： 2 ） 包装质粒信息如下： PMD2G 载体图谱和序列信息 PSPAX2 载体图谱和序列信息： 细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株大肠杆菌菌株DH5 α。用于扩增 慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、流程图