最新WB实验步骤详细总结资料.docxVIP

蛋白提取（所有操作在冰上进行） 裂解 1） 配裂解液：PMSF=100 : 1，（裂解液和 PMSF在-20 C保存，提前一天 4C解冻） 取2ml裂解液，加20 M PMSF混匀 2） 称取30mg组织，切碎放入标记好的 AP管中，加入600讪上述1中液体（加入液 体与组织比例为 20： 1），冰上静置10mi n 匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆 10s,两次（间隔5s），冰上静置30min 离心（在基础4楼416室） 1） 自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个 1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量 超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置） 2） 将离心机预冷至 4 C为止，以1200X10r/min离心15min 3） 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 变性（上样缓冲液：样品=4: 1） 将样品转移至2~3个0.5mlAP管中 加上样缓冲液，100 C变性10mi n 仪器屏幕： S5 00 : 10 S5 100 . 0 00 : 10 1 温度（C） 时间（时：分钟） 5. 保存 变性结束后，打开 AP管盖放一下气，然后 4C保存，点样是取出即可用 WB实验步骤 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干， 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧， 操作时要使两玻璃对 齐，以免漏胶。 配制分离胶 1） 准备：1ml枪（蓝色枪头），200讪枪（黄色枪头）10讪（白色枪头） 2） 10%分离胶的配置：（用 50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板） 5.91ml 超纯水 4.95ml 丙烯酰胺（30% ）避光保存极易失效 3.75ml Ph8.8Tris ?HCL 150 M 10%SDS 150 AP （催化剂促凝作用） 9讪 TEMED 混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡） 灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用 1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出 防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止 水封 立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响 电泳效果，等待20-30mi n 浓缩胶的配制（5% ） 4.13ml 超纯水 1ml 丙烯酰胺（30% ）避光保存极易失效 750 M Ph6.8 Tris ?ICL 60 m 10%SDS 60 M AP （催化剂促凝作用） 6讪 TEMED 搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（ 10孔或15孔）凝胶30min或20min 电泳（电泳液最多使用两次） 1） 安装电泳装置 低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔 岀防止拔歪） 2） 点样（不易时间过长，防止样品条带扩散） Mark 4讪 （Protern ladder ）推荐9禺实际4卩已经足够 样品 8讪 7-10讪均可内参挑齐即可 组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪 3） 连接电泳仪 电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳 先调电压至70mV，跑约20min。（ Mark跑开，分出彩带即可） 再调电压至120mV，跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板） 注：Mark的条带从红色条带往下依次为： 70 -55 -40- 35 -20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在 哪L段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸 泡 转膜（转移液可用3-4次） 1） 剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终 保持湿润） 2） 剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触 PVDF膜），然后用甲醇活化 10s以上 3） “夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、 两层滤纸-胶-膜-两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方） 4） 安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动） 5） 6） 打开开关，调节电流至 100mA，转膜2h （恒流）盆中加满冰 转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色 圭寸闭 2） 配制5%脱脂奶粉： 2.5g脱脂奶粉 卜 小烧杯中混匀加入皿中 50mlTBST 3） 4） 将膜取出放入上述加入了 5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇 60min （转移液回收其余清理掉， 转移 液可以重复利用2次） 9. 一抗 1) 2） 用TBST配，每一格加 5ml TBST，再分别加入抗体 抗体的量: 2l (Psmad2l)免抗 1:1000 5 讪：5ml 58 （分子量） 2l (Psmad2l)免抗 1:500 10 讪：5