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基因工程的基本操作程序 原核细胞的基因结构 原核细胞基因 编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的 合成，即能够编码蛋白质 非编码区（调控序列）：位于编码区上游和 编码区下游的 DNA 序列，虽不 能指导有关蛋白质的合成，但 有调控遗传信息表达的核苷酸 序列，如启动子、终止子等 原核细胞的基因结构 RNA 聚合酶的作用是催化 DNA 转录为 RNA 。 它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 转录开始后， RNA 聚合酶沿 DNA 分子移动，并 与 DNA 分子的一条链为模板合成 RNA 。 真核细胞的基因结构 与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是： 编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码 蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成 为一种断裂的形式。 其中，能够编码蛋白质的序列叫做 外显子 ，一般不 能够编码蛋白质的序列叫做 内含子 。 真核细胞的基因结构 真核细胞基因 编码区 （间隔、不连续） 外显子：能编码蛋白质 的 DNA 序列 内含子：不能编码蛋白 质的 DNA 序列 非编码区：与原核生物具有相似功能的启 动子、终止子 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 连续的 编码区是间隔 的、不连续的 相同点 都由能够编码蛋白质的编 码区和具有调控作用的非 编码区组成的 基因的种类 （ 1 ）编码蛋白质的基因：包括结构基因和 调节基因。 （ 2 ）没有转译产物的基因：如 rRNA 基因 和 tRNA 基因。 （ 3 ）不能转录的 DNA 片段：如操纵基因。 启动子与终止子 启动子是在非编码区内紧靠转录起点， 调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它 能引导 RNA 聚合酶与正确的基因部位结合， 使转录从起点开始，沿编码区进行。 终止子是在非编码区内紧靠转录终点， 调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它 能阻碍 RNA 聚合酶的移动，并使其从 DNA 模板链上脱离下来，使转录终止。 基因工程的基本操作流程 基因组文库和部分基因文库 基因组文库 部分基因文库 基因组文库和部分基因文库 cDNA 合成过程 ? 第一步，反转录酶以 RNA 为模板合成一条与 RNA 互 补的 DNA 单链，形成 RNA-DNA 杂交分子。 ? 第二步，核酸酶 H 使 RNA-DNA 杂交分子中的 RNA 链降解，使之变成单链的 DNA 。 ? 第三步，以单链 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶的作用 下合成另一条互补的 DNA 链，形成双链 DNA 分子。 利用 PCR 技术扩增目的基因 原理 : DNA 双链复制 前提 : 要有一段已知 目的基因的脱 氧核苷酸序列， 以便合成引物。 获取目的基因 ? 从基因文库中获取 ? 利用 PCR 技术扩增 ? 利用化学方法人工合成 构建表达载体 表达载体的组成 1. 目的基因 2. 启动子 3. 终止子 4. 标记基因 基因工程载体的构建需要考虑哪些因素 （ 1 ）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内 含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子 的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的 内含子剪切掉，只能用该基因的 cDNA 。基因的产 物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌 中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性， 因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上 的，而细菌无这些细胞器。 （ 2 ）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强 有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产 物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达， 如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达 的启动子。 （ 3 ）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真 正的转基因生物。 将目的基因导入受体细胞（植物细胞） 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 将目的基因导入受体细胞（动物细胞） ? 显微注射法 将目的基因导入受体细胞（微生物细胞） ? Ca 2+ 处理