总RNA提取及QPCR标准操作流程.docxVIP

总 RNA 提取及反转录标准操作流程 一、仪器试剂 Trizol 试剂 三氯甲烷（ 4℃ 预冷） 异丙醇（ 4℃ 预冷） 75%乙醇（ DEPC 处理水配置）（ 4℃ 预冷） DEPC 处理水 /RNase free water（反转录试剂盒） 无酶 EP管 200 μL无酶 PCR 管 冷冻离心机 Nano Drop 2000 反转录试剂盒（ Takara RR036A ） 二、实验须知 选择人员走动较少的实验台或超净台（无须打开风机）操作。 操作及观摩人员必须佩戴干净的一次性手套及口罩。 尽可能在冰盘上操作。 3. 取 EP 管时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完 EP 管后，袋子及时封好。 Trizol 含剧毒，若溅到皮肤上，请立即用清水冲洗；若溅到眼内，立即大量清水冲洗，并送医就诊。 三、样品处理 组织样品 将组织在液 N 中磨成粉末后， 再以 50-100mg 组织加入 1ml Trizol 溶液，混匀，室温放置 5min 使其充分裂解。 注 1：样品总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10%。 注 2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并 -80 摄氏度保藏。胰腺组织样品因其各种酶 含量极其丰富，应尤为注意，研磨过程中注意保持样品低温状态。 贴壁细胞样品 弃去细胞培养皿中培养基， 根据下表加入适量  Trizol  溶液，吹打混匀， 并吸至 无酶  EP 管中， 室温静置 5min ，使细胞充分裂解。 培养皿 Trizol 体积 皿（ 6 孔板） 1mL 6cm 皿 3mL 10cm 皿 10mL 注：加入 Trizol 溶液后，可将培养皿放入 -80℃冰箱， 20min 后取出化开，通过冻融增加细胞 裂解效果。 悬浮细胞 500g× 5min 离心收集细胞， 弃去培养基， 约 5-10× 106 细胞加入 1mLTrizol 溶液， 吹打混匀， 室温静置 5min ，使细胞充分裂解。 注：某些酵母或细菌细胞须超声裂解。 注意事项 1）样品裂解液可室温存放数小时， -80℃ 可至少存放一月。 2）若样品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物质，如脂肪、肌肉或块茎植物等样品，可增加 一步离心操作，具体步骤如下： ○ 、 4℃ 离心 10min ，胞外基质、多糖、高分子量 DNA 将会形成颗粒沉淀于底部， 1 12000g RNA 包含于上清中，而高脂样品会在上清液上方形成一层脂肪层。 ○2 移除脂肪层，将澄清的上清液移至新的无酶 EP 管中。 四、总 RNA 提取 1. 每 1mL Trizol 溶液加入 200 μL 三氯甲烷，立即盖上盖子，剧烈振荡 15s，使水相和有机相 充分接触，室温静置 3-5min 。 2. 4℃ 下， 12000g 离心 15min ，液体分为三层， RNA 位于上层水相，约占总体积的 50%，移 至新无酶 EP 管中（用 20-200μL 的枪吸取上清，吸上清时， EP 管倾斜大约 45 度，枪头应沿 着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 。 加入等体积异丙醇， 轻柔地充分混匀 （颠倒 6-8 次，不应用振荡器混匀） ，室温静置 10min 。 4℃ 下， 12,000g 离心 10min ，可见羽毛状白色 RNA 沉淀，小心吸出上清。 4. 1mL 75% 乙醇洗涤两次（ 4℃ 7500g 离心 5min，加入乙醇后只需轻轻颠倒 EP 管即可，不 可使用振荡器震荡或枪头吸打沉淀） 。 注： RNA 可与 75%乙醇中 4℃ 保存一周， -80℃ 保存一年。 5. 室温干燥室温或真空干燥 5-10min ，注意不要干燥过分，否则会降低 RNA 的溶解度。视 沉淀量加入适量 DEPC 水（至少 15μL）溶解沉淀，使用 Nano Drop 测定 RNA 浓度。 首次提取 RNA 时须跑胶验证 RNA 质量，核酸胶配置为： 1%琼脂糖 /1× TAE 缓冲液，取 5μLRNA 溶液混上 μL Loading Buffer ，上样跑胶，电泳大概 15min ，凝胶成像仪上观察 RNA 条带质量， RNA 条带一般为三条，理想的 RNA 条带为：明亮的 28S 条带与 18S 条带，并且 28S 条带亮度大约为 18S 条带两倍，微弱或没有 5S 条带。 五、反转录 用 Prime Script TM 反转录试剂盒（ Takara RR036A ）将总 RNA 反转录成 cDNA 。 1. 于 200μL无酶 PCR 管中按反应体系配置 RT 液。 反应体系如下： 试剂 使用量 终浓度 5×Prime Script RT Master Mix （ Perfect Real Time ） 2μL 1× 总 RNA 500ng