犬细小病毒胶体金试纸条的研制及初步应用.pdfVIP

摘 要 由犬细小病毒(Canine parvovirus)引起的犬细小病毒病（Canine parvovirus disease，CPVD ）是 一种急性烈性传染病，该病的自然感染宿主主要是犬，尤其是幼犬更易感，临床症状主要表现为 出血性肠炎型和心肌炎型两种。该病传播速度快、发病率和死亡率极高，给养犬业和经济动物养 殖业的发展造成了巨大的经济损失。因此，建立一种快速、准确的诊断方法对CPVD 的预防具有 重要意义。 本研究利用纯化的CPV 与弗氏佐剂乳化免疫雌性BALB/c 小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞与骨 髓瘤细胞 （SP2/0）进行细胞融合，采用间接ELISA 方法筛选杂交瘤细胞，经三次亚克隆，共筛 选到 3 株与CPV 特异性反应的细胞株，分别命名为 1D9、3G9 和4F6 。亚类鉴定结果显示1D9 和3G9 重链为IgG1，4F6 重链为IgG2b，轻链均为kappa 链。利用秋水仙素法对杂交瘤细胞染色 体数目进行测定，结果显示三株单克隆抗体的染色体数分别为92、94、98 。将1D9、3G9 和4F6 4 5 分别接种小鼠腹腔制备腹水，腹水间接ELISA 检测效价为 10 -10 。中和实验表明：4F6 腹水完 全中和病毒的中和效价为 1：512。交叉试验表明，三株单克隆抗体均可与CPV 特异性结合，与 其他犬类常见病毒无交叉反应，特异性良好。 进而利用获得的单克隆抗体制备胶体金免疫层析试纸条。以纯化的单克隆抗体3G9 作为金标 抗体，4F6(0.8mg/ml)作为检测线，羊抗鼠 IgG(1mg/ml)作为质控线组装试纸条。该试纸条能够检 测到CPV 的最低浓度为0.0062mg/mL，且与犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒Ⅱ 型(CAV)等无交叉反应。最后用组装的试纸条和PCR 技术对30 份疑似CPV 感染的临床样品进行 检测。结果显示，两者间的阳性符合率为92.3% （24/26 ），阴性符合率为100% （4/4 ），故总的符 合率为93.3%[ （24+4 ）/30] 。该结果表明，本研究制备的胶体金免疫层析试纸条能够快速、特异 地检测临床样本中的CPV，可初步应用于CPVD 的诊断中。 综上所述，本研究成功制备了三株效价高且特异性好的抗 CPV 的单克隆抗体，并利用单克 隆抗体制备了胶体金免疫层析试纸条，该试纸条具有敏感、特异、快速、简便等特点，与 PCR 技术相比具有较高的符合率，为我国CPV 的诊断及免疫预防提供技术手段。 关键词：犬细小病毒，单克隆抗体，胶体金试纸条 I Abstract Canine parvovirus disease (CPVD) is an acute and severe infectious disease caused by Canine parvovirus. The natural infection host of the disease is mainly dogs, especially puppies, which are more susceptible. The clinical symptoms are mainly manifested as hemorrhagic enteritis and myocarditis. The rapid spread of the disease, the extremely high morbidity and mortality rates have caused huge economic losses to the development of the dog industry and economic animal breeding industry. Therefore, the establishment of a rapid and accurate diagnostic meth