苹果U6启动子的克隆及转录活性分析.pdfVIP

摘 要 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术在植物功能基因组学和植物分子育种研究中展现出广阔的应 用前景，已应用于多种植物。目前该体系已在苹果 （Malus ×domestica ）中实现基因编辑但进展较 缓慢。U6 启动子是CRISPR/Cas9 基因组编辑载体中驱动sgRNA 转录的重要元件，其转录活性受 亲缘关系和序列长度的影响。因此，筛选出合适的苹果内源 U6 启动子，将进一步优化苹果 CRISPR/Cas9 基因编辑体系。 ‘金冠’苹果基因组中存在多条U6 snRNA ，本研究选择E-value ＜ 3e-40 的6 条U6 snRNA，取其转录起始位点上游1 500 bp 外加27 bp snRNA 序列作为候选U6 启 动子进行比对分析。而后设计引物克隆并构建 U6 启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase ，LUC ）的融合表达载体，利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏 烟草（Nicotiana benthamiana ）叶片，通过检测荧光素酶活性对各候选U6 启动子进行转录活性比 较。筛选到一条转录活性最高的U6 启动子后，对其从5端进行不同长度截短，并进行转录活性 分析。获得的研究结果如下： 1. 从 ‘金冠’苹果基因组中选择E-value 值小于3e-40 的6 条U6 snRNA （分别位于6、7、9、 10、15 和17 号染色体）用于本研究。将6 条长度为 1 527 bp 的候选U6 启动子同拟南芥U6-1 启 动子进行序列比对分析，发现苹果U6 启动子均存在-60 bp 的上游序列元件（Upstream sequence element ，USE ）和-30 bp 的TATA-like Box ，两者间距离也非常保守。另外，6 条苹果U6 启动子 均以‘G ’碱基为转录起始位点。 2. 对瞬时转化后的烟草叶片和苹果愈伤组织进行荧光素酶活性检测，通过荧光信号采集对6 条候选苹果U6 启动子的转录活性进行比较。结果显示，6 条候选苹果U6 启动子均具有转录活性， 其中 10 号染色体上U6 启动子的转录活性最高。利用同样的方法对10 号染色体上从5端截短后 的U6 启动子（长度分别为1 500、959、275 和116 bp）进行转录活性比较。结果显示，长度为 275 bp 的U6 启动子转录活性最强。 3. 在苹果愈伤组织中，将筛选到的长度较短且转录活性较高的苹果 U6 启动子同拟南芥U6 启动子进行转录活性比较，发现苹果U6 启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6 启动子。 综上所述，本试验从苹果基因组中筛选到一条序列长度较短且转录活性较高的苹果U6 启动 子，为优化苹果CRISPR/Cas9 基因编辑体系提供了候选U6 启动子。 关键词：苹果，启动子，转录活性，U6 snRNA I Abstract CRISPR/Cas9 genome editing technology has been successfully applied to a variety of plants and has a broad application prospect in plant molecular breeding. At present, the application of gene editing technology has made slow progress in apple (Malus ×domestica). U6 promoter is an important element for the transcription of sgRNA in the CRISPR/Cas9 genome editing system, and its transcriptional activity may be affected by genetic relationship and sequence length. Therefore, selecting an apple U6 promoter with