农产品赭曲霉毒素A核酸扩增检测技术研究.pdfVIP

摘 要 赭曲霉毒素是一类真菌次生代谢物，主要由曲霉菌属和青霉菌属的某些种产生，其中赭曲霉 毒素 A （Ochratoxin A ，OTA ）毒素强，污染广，一旦污染了农产品则很难降解去除。因此，开发 具有高灵敏度的检测方法显得尤为重要。近年来，核酸扩增技术拓展应用于真菌毒素检测，并被 认为是推动真菌毒素与食源性致病菌同步检测的重要平台。然而，因为真菌毒素是小分子化合物 无法直接扩增，所以使得真菌毒素的核酸扩增技术一直难以突破。 针对上述难题，本研究以 OTA 为研究对象，采用实验室前期成功研制出 OTA 抗独特型纳米 抗体噬菌体 (phage VHH 2-21) 作为研究材料，利用噬菌体展示抗体同时具备抗体和对应 DNA 的 特点，研究探讨并建立了农产品 OTA 的三种核酸扩增检测方法。本研究具体内容和创新点如下： 1.研究建立了农产品 OTA 的基于 SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时免疫 PCR 检测方法。 本研究以 phage VHH 2-21 为研究材料，通过棋盘法得出了该批次噬菌体展示抗独特型纳米 抗体和作包被抗原的最佳免疫工作浓度。针对噬菌体中该抗独特型纳米抗体的核酸序列设计特异 性引物，通过后续的扩增得到的熔解曲线和扩增效率证明其正确性。使用标准浓度的 phage VHH 2-21 ，从引物浓度和退火温度两个方面优化基于 SYBR Green Ⅰ 荧光染料的实时免疫 PCR 扩增条 件。采用梯度稀释的 phage VHH 2-21 ，在优化得到的条件下进行实时免疫PCR ，根据计算得到的 扩增效率验证优化得到条件正确性并再次确认引物设计的合理性。采用上述的最优条件，建立了 农产品 OTA 基于 SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时免疫 PCR 检测方法的标准曲线，其灵敏度为 0.03 ng/mL ，检测限为0.003 ng/mL 。采用玉米、大米和小麦三种基质对基于 SYBR Green Ⅰ 荧光染料 的实时免疫PCR 检测方法进行基质效应评价，得出经过添加 BSA 或用石油醚脱脂处理后的基质 对该方法的影响不显著。采用 2 ng/mL 、5 ng/mL 和 10 ng/mL 三个梯度赭曲霉毒素 A 标准品进行 添加回收分析，得到该方法的加标回收率为 88.7%-113.4%，符合回收率要求（80%-120%）。因此 本研究中建立的基于 SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时免疫 PCR 检测方法适用于农产品产品中 OTA 的检测。 2.研究建立了农产品 OTA 的基于Taqman 探针的实时免疫 PCR 检测方法。 本研究以 phage VHH 2-21 为研究材料，针对噬菌体中该抗独特型纳米抗体的核酸序列设计 特异性引物和 Taqman 探针，通过后续的扩增效率证明其正确性。使用标准浓度的 phage VHH 2- 21 ，从引物浓度、探针浓度和退火温度三个方面优化基于 Taqman 探针的实时免疫 PCR 扩增条 件。采用梯度稀释的 phage VHH 2-21 ，在优化得到的条件下进行实时免疫PCR ，根据计算得到的 扩增效率验证优化得到条件正确性并确认引物设计的合理性。采用上述优化的 phage VHH 2-21 和 包被抗原的最佳免疫工作浓度和 Taqman 探针的实时免疫 PCR 最佳扩增条件建立标准曲线，得到 其灵敏度为 0.012 ng/mL，检测限为 0.001 ng/mL 。采用玉米、大米和小麦三种基质对基于Taqman 探针的实时免疫 PCR 检测方法进行基质效应评价，得出经过添加 BSA 或用石油醚脱脂处理后的 基质对该方法的影响不显著。采用 2 ng/mL 、5 ng/mL、10 ng/mL，三个梯度赭曲霉毒素A 标准品 进行添加回收分析，得到该方法的加标回收率为 88.3%-109.6%，符合回收率要求（80%-120%）。 因此，本研究中建立的基于 Taqman 探针的实时免疫 PCR 检测方法适用于农产品产品中 OTA 的 检测。 3.研究建立农产品 OTA 的实时免疫多引物滚环等温扩增检测方法。 I 本研究使用标准浓度的 phage VHH 2-21 ，从引物浓度、phi29 DNA 聚合酶浓度、酵母焦磷酸 酶浓度三个主要参数优化实时免疫多引物滚环扩增的扩增条件。采用上述优化的 phage VHH 2-21