淬灭酶AiiO-AIO6调控鱼类抗病机制研究.pdfVIP

摘 要 N-酰基高丝氨酸内酯酶（N-acyl homoserine lactonase ）是一类特异性降解N-酰基高丝氨酸内 酯（AHLs ）类信号分子的淬灭酶，广泛存在于多种微生物中。淬灭酶可以预防多种细菌性疾病 的传播，降低细菌耐药性的产生，为水产病害防治提供有效环保的措施，因此需要进一步研究该 类酶制剂在实际应用中的预防效果和在宿主中的作用机制。本文围绕淬灭酶AiiO-AIO6 调控鱼类 肠道菌群组成展开研究，为淬灭酶在水产中的应用提供依据。 本研究首先进行淬灭酶AiiO-AIO6 对鱼类核心病原菌维氏气单胞菌毒力的体外研究试验。将 不同酶活单位的AiiO-AIO6 与鱼类病原菌维氏气单胞菌共培养24 h ，然后检测细菌的生长、生物 膜形成及毒力的变化。结果表明AiiO-AIO6 不影响维氏气单胞菌的生长，但能抑制其生物膜的形 成且呈剂量依赖效应；维氏气单胞菌的毒力因子Aer 的表达和活性在24 h 时显著降低，降低到未 添加组的44.3% ，其溶血性也有一定程度的下降。 在确定淬灭酶 AiiO-AIO6 可以在体外有效降低维氏气单胞菌的毒力后，为了说明淬灭酶 AiiO-AIO6 对维氏气单胞菌的体内作用效果，我们研究了AiiO-AIO6 饲喂斑马鱼后对维氏气单胞 菌浸浴攻毒的保护率。结果发现，和对照组 （存活率为43.33% ）相比，饲喂2 天可以明显提高斑 马鱼攻毒存活率，免疫保护率增加30%，而饲喂7 天后的鱼体抗病力较对照组显著降低，免疫保 护率减少20% 。然后使用实时定量q-PCR 和Western blot 检测AiiO-AIO6 饲喂不同周期后斑马鱼 肠道的免疫指标，结果发现饲喂2 天的低氧诱导因子HIF-1α 的表达增加和促炎介质NF-κB 的表 达降低，而饲喂7 天的结果恰好相反。 为了进一步说明AiiO-AIO6 调控斑马鱼抵抗维氏气单胞菌感染的作用方式，借助16S rRNA 高通量测序、无菌斑马鱼模型和肠道微生物菌群转接实验证明AiiO-AIO6 通过调节肠道菌群中邻 单胞菌、气单胞菌和鲸杆菌的比例而改变其对斑马鱼的攻毒保护效果。因此AiiO-AIO6 调控斑马 鱼对维氏气单胞菌的抗感染能力是通过介导肠道菌群间接发挥的作用，这些菌群变化能通过引起 斑马鱼肠道HIF-1α 和NF-κB 的变化从而影响斑马鱼免疫能力，而不是通过淬灭酶本身的作用。 最后以斑马鱼饲喂AiiO-AIO6 后肠道中发生显著变化的优势菌属鲸杆菌、邻单胞菌和气单胞 菌为例，通过实时定量q-PCR 分析它们各自浸浴无菌斑马鱼后对宿主肠道免疫因子的影响。结果 显示与气单胞菌和邻单胞菌共培养后，斑马鱼的缺氧诱导因子HIF-1α 的mRNA 相对表达量下调， 且促炎介质 NF-κB 的 mRNA 相对表达量上调；而与鲸杆菌共培养后，斑马鱼的缺氧诱导因子 HIF-1α 的mRNA 相对表达量上调，促炎介质NF-κB 的mRNA 相对表达量无明显差异。 综上所述，本试验研究了淬灭酶AiiO-AIO6 调控鱼类肠道菌群稳态的机制，发现AiiO-AIO6 能有效抑制病原菌生物膜的形成，降低其关键毒力因子 Aer 的表达和溶血能力。饲喂 2 天 AiiO-AIO6 能提高对斑马鱼的攻毒保护率，饲喂7 天AiiO-AIO6 则降低对斑马鱼的攻毒保护率。 进一步研究发现，AiiO-AIO6 调控斑马鱼对维氏气单胞菌的抗感染能力是通过改变肠道菌群介导 的间接作用，而不是通过淬灭酶本身来发挥作用。该研究将为群体感应淬灭酶应用于水产细菌性 病害的生物防治奠定理论基础。 关键词：淬灭酶，维氏气单胞菌，浸浴攻毒，肠道微生物，免疫 I Abstract N-Acyl homoserine lactonase is a class of quorum-quenching enzymes that can specially degrade N-Acyl homoserine lactone and is widely present in a variety of bacterial species. Quorum quenching enzymes can prevent