异沙叶蝉与小麦黄条纹病毒互作及内生呼肠孤新病毒的鉴定.pdfVIP

摘 要 异沙叶蝉是一种重要的农业害虫，其寄主广泛，并可通过取食植物汁液传播小麦矮缩病毒和 一种新型弹状病毒-小麦黄条纹病毒（wheat yellow striate alphanucleorhabdovirus ，WYSV ）。切断 异沙叶蝉对病毒的传播是防治病毒病害最行之有效的方法之一，而阐明异沙叶蝉与病毒的互作机 制是明确传毒机制的关键。因此本研究以异沙叶蝉及其传播的 WYSV 为研究对象，筛选异沙叶 蝉体内与传播 WYSV 相关的介体蛋白并解析其功能，为阻断以异沙叶蝉传播植物弹状病毒提供 新的位点靶标。 本研究首先利用RNA-seq 技术分析了携带WYSV 的异沙叶蝉转录本，与健康对照组相比， 共鉴定出2896 个差异表达基因，其中 745 个为上调表达基因，2151 个为下调表达基因。GO 功 能注释表明这些基因参与了几丁质代谢、糖代谢以及囊泡运输等多种生物学过程。进一步利用 WYSV G 蛋白抗体通过免疫共沉淀（CO-IP ）实验，结合质谱分析的方法从异沙叶蝉体内共筛选 到20 种候选蛋白，包括膜组分的跨膜蛋白 5，参与胞吐的Exocyst 复合成分 1 （SEC3 ），参与神 经传输的乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor subunit alpha-L1，ARSA1 ），细胞骨架的结构成分 微管蛋白β 链等等。由于弹状病毒以胞吞的方式侵入细胞，且可侵染介体昆虫的神经系统，故以 SEC3 和 ARSA1 两种蛋白为重点进行深入研究。因WYSV 糖蛋白（G ）整段表达对细胞产生毒 性，故分段构建了WYSV G 蛋白的两个酵母双杂交诱饵载体 PBT3-N-G （1-615 ）和 PBT3-N -G （664-1983），同时成功构建了两个候选蛋白的猎物载体pPR3-N -SEC3 和pPR3-N-ARSA1 。自激 活验证实验表明PBT3-N -G （1-615 ），pPR3-N -SEC3 和pPR3-N -ARSA1 能正常在酵母细胞中表达 并行使功能，而 PBT3-N -G （664- 1983）不能表达和正常行使功能。进一步采用分离泛素酵母双 杂交系统和β-半乳糖苷酶实验进行功能验证，结果表明截短表达蛋白WYSV-G （1-615 ）与SEC3 和ARSA1 两种介体蛋白均能发生互作，为研究异沙叶蝉传播WYSV 的分子机制奠定基础。 此外，本研究通过透射电镜观察结合高通量测序技术发现了一种新型 dsRNA 病毒，暂命名 为异沙叶蝉呼肠孤病毒（Psammotettix alienus reovirus ，PARV) ，其在异沙叶蝉体内高度复制但不 引起病变，为不侵染植物的昆虫呼肠孤病毒。透射电镜观察发现在异沙叶蝉唾液腺细胞中大多呈 晶状体排列的、直径约为70 nm 的球型病毒粒体，并存在与其他呼肠孤病毒类似的管状结构。PARV 全长基因组为29569 个核苷酸（nt ），由大小不等的10 个dsRNA 片段组成（从4403 nt 到1476 nt ）， 每个片段 G+C 含量均较低，为 29.5% -36.5%之间，每个片段都含有呼肠孤病毒末端保守序列 （5’AAC…GUCA3’）。基于依赖于RNA 的RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase ，RdRp ） 进行的系统发育树分析表明PARV 应为呼肠孤病毒科（Reoviridae ）斐济病毒属（Fijivirus ）的一 个新种。以上研究结果为异沙叶蝉与其传播病毒的分子互作机制以及昆虫病毒进化研究奠定了基 础。 关键词：异沙叶蝉，小麦黄条纹病毒，异沙叶蝉呼肠孤病毒，传毒机制，昆虫病毒 I Abstract Psammotettix alienus is an important agricultural pest that has a wide range of hosts , which can transmit wheat dwarf virus and wheat yellow striate alphanucleorhabdovirus (WYSV). It was one of th