基于核酸扩增技术的高值乳品快速鉴别方法研究.pdfVIP

摘 要 2008年爆发的“三鹿奶粉”事件使得乳品安全受到社会的广泛关注，对于营养价值比较高、市 场价格也相对较高的高值乳，如骆驼奶、驴奶、牦牛奶等适合于特殊人群的乳品，一些不法商家 在利益的驱使下，向其中掺入价格低廉的乳品，不仅损害了消费者的权益，更会产生一些健康问 题，因此建立一种快速、灵敏的乳品掺假鉴别方法具有重要意义。目前，乳品物种掺假鉴别面临 两大问题：一是缺乏现场快速检测技术；二是缺乏定量掺假鉴别技术。针对于这两个问题，本研 究基于市面上常见的6个物种的液态奶开发了一种液态奶DNA 快速提取的方法；并在此基础上， 开发了基于胶体金试纸条的牦牛奶快速鉴别方法；同时，根据不同物种DNA 序列的差异，以单 拷贝核基因为靶基因设计骆驼和驴的特异性引物，并以内参基因为对照，应用荧光定量PCR 技 术建立了骆驼奶和驴奶的掺假定量鉴别方法。主要研究内容和结论如下： （1）开发了一种液态奶基因组DNA 快速提取方法。研究了不同裂解液的裂解效果，并优化 裂解条件，发现在 1mL 液态奶中加入300 μL0.5mol/L 的NaOH 裂解液，100℃下煮沸5min， 取出后，13400r/min 离心10min，取中间清液作为DNA 模板，即能提取到不同物种液态奶的 DNA，在PCR 扩增中经过琼脂糖凝胶电泳检测，检测限可达 1%的牛奶含量。 （2）开发了一种基于RPA 技术的侧流层析核酸试纸条 （LFNAA），用于牦牛奶的鉴定。采 用特殊的加尾终止引物，使得RPA 扩增形成一种携带单链核苷酸尾巴的特殊产物，能够与胶体 金标记的捕获探针杂交。同时，正向引物修饰的生物素能够被测试线上的链霉亲和素捕获，形成 一个 “三明治结构”的复合物，在检测线上形成肉眼可见的红色条带，而过量的金标捕获探针则 继续流向质控线，被捕获显示红色条带。该方法无需使用抗体，降低了以免疫分析技术为基础的 侧流层析试纸条的成本。在37~42 ℃的反应条件下扩增20min，即可在5min 内直接用肉眼观察 结果，可在牦牛奶和牛奶的混合物中检测到低至5%的牦牛奶。在没有复杂仪器的情况下，整个 扩增和检测过程在40min 内完成，非常适合现场检测的要求。 3 开发了一种可用于骆驼奶和驴奶掺假含量测定的荧光定量PCR 方法。分别选择骆驼的 （） 单拷贝核基因心脏发育蛋白基因和驴的单拷贝核基因生长激素受体基因作为特异性基因，选择肌 肉生长抑制基因作为通用性内参基因，基于特异基因和内参基因的Ct 值比率与骆驼奶或驴奶含 量的线性关系，建立了骆驼奶和驴奶的掺假定量标准曲线。线性公式分别为Y -0.0017x+ 1.1319 （骆驼奶）和Y -0.0023x + 1.2288 （驴奶），相关系数分别为0.9615和0.9650，模拟掺假样品 的回收率均在90%~ 120%的范围，CV10%，批次内分析结果的CV 值均5%，批次间分析结果 的CV 值均6%。该方法减少了不同的DNA 提取方法、以及PCR 扩增效率带来的误差，为掺假 液态奶中骆驼奶和驴奶的百分含量测定提供了一种简便、快速的方法。 关键词：乳品，掺假，荧光定量PCR，侧流层析核酸试纸条，快速检测 I Abstract In 2008, the outbreak of the Sanlu milk powder incident makes dairy safety received extensive attention of society. For the high nutritional dairy products which means higher nutrition and higher market price, such as camel milk, donkey milk and yak milk for the special groups, some illegal businessmen adulterate high-value milk products with low-cost dairy product under the drive of interests,which not only harm therights of consumers,but perhapsproduce some health pr