大片形吸虫硫氧还蛋白谷觥甘肽还原酶的特性研究及其抑制物的筛选.pdfVIP

摘 要 片形吸虫病是由大片形吸虫和肝片形吸虫寄生在草食性哺乳动物或人的肝胆内引起的一种 人畜共患寄生虫病。硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶 （TGR ）是片形吸虫氧化还原系统中一个非常重 要的抗氧化酶，TGR 抑制物的研究和筛选可为研发抗大片形吸虫的新药物提供理论依据。 本研究利用 PCR 技术从大片形吸虫 cDNA 中扩增得到FgTGR 基因，并将细菌的硒代半胱氨 酸插入元件（SECIS）融合到FgTGR 的开放阅读框末端，形成嵌合基因FgTGR- SECIS，构建FgTGR 的重组原核表达质粒pET-28a(+)-FgTGRsec ，将重组质粒转化至 BL21 （DE3 ）感受态细胞进行诱 导表达得到重组蛋白 rFgTGR 。将重组质粒与硒蛋白表达工程质粒 pSUABC 共转化至 BL21（DE3 ） 感受态细胞进行诱导表达，在表达过程中添加亚硒酸钠和 L- 半胱氨酸，得到重组硒蛋白 （rFgTGRsec ）。通过 His-tag 蛋白纯化磁珠分别对两种蛋白进行纯化。建立了rFgTGRsec 的TrxR、 GR、GrxR 三种酶活性检测体系，通过测定 DTNB 和 NADPH 的吸光值变化，分别计算 rFgTGRsec 的TrxR、GR 和GrxR 活性。在金属催化氧化系统（MCO ）中加入超螺旋质粒与不同量的rFgTGRsec ， 通过 DNA 琼脂凝胶电泳观察超螺旋质粒的变化情况，判定 rFgTGRsec 的抗氧化功能。将 rFgTGR 注射免疫小鼠，以获得抗 rFgTGR 的小鼠血清用于免疫组织化学实验，观察 TGR 在大片形吸虫 的组织分布情况。最后检测了62 个新型 Furoxan 衍生物对 rFgTGRsec 中TrxR 活性的作用效果， 筛选抑制效果较好的化合物。 本研究成功诱导表达了 rFgTGR 和 rFgTGRsec，两种蛋白均以可溶性蛋白和包涵体两种形式 表达，大小约 71 kDa ，rFgTGR 表达量比 rFgTGRsec 高。建立的TrxR、GR、Grx 三种酶活性检 测体系的检测结果显示，纯化的 rFgTGR 的TrxR 酶活性为 24.28 ± 1.51 U/mL，纯化的rFgTGRsec 的TrxR 酶活性为 54.47 ± 11.66 U/mL，GR 酶活性为 71.14 ± 11.48 U/mL，Grx 酶活性为 11.86 ± 1.88 U/mL 。TrxR 以DTNB 为底物的米氏常数为 189.39 ± 52.90 μmol/L，硒的插入对 TrxR 酶活性有明 显的提高，说明硒在 FgTGR 的功能中发挥重要作用。MCO 质粒保护实验显示，rFgTGRsec 在体 系中的浓度达到 50 μg/mL 时，开始对 DNA 超螺旋结构产生保护作用，但在 600μg/mL 时，仍未 能产生完全的保护效果，说明 rFgTGRsec 具有一定的抗氧化活性。免疫组织化学实验表明，大片 形吸虫TGR 在虫体中呈广泛分布。在检测的 62 个新型 Furoxan 衍生物中，筛选出LGM-1、LGM-2 、 LGM-35、ZWJ-19 和 CH-33 五个抑制效果较好的化合物，其 IC50 值分别是 6.93 ± 1.74 μmol/L、 15.19 ± 0.80 μmol/L、4.5 ± 0.35 μmol/L、3.82 ± 0.33 μmol/L 和 18.54 ± 2.57 μmol/L 。 本研究为后续 FgTGR 的抑制物筛选以及研制新的抗片形吸虫药物奠定了基础。 关键词：大片形吸虫，硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶，硒蛋白，酶活性，Furoxan I Abstract Fascioliasis, is a parasitic disease caused by Fasciola hepatica (F. hepatica) and Fasciola gigantica (F. gigantica),which reside in the biliary duct and liver. Thioredoxin glutathione r