山羊传染性胸膜肺炎新诊断分子的筛选与评价.pdfVIP

摘 要 山羊传染性胸膜肺炎（Contagious Caprine Pleuropneumonia, CCPP）是由山羊支原体山羊肺炎 亚种（Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mccp）引起的一类严重呼吸道疫病，主要 危害山羊和一些野生羊，被世界动物卫生组织（OIE ）列为报告动物疫病之一。CCPP 流行区域横 跨亚洲、中东、非洲40 多个国家，主要表现为呼吸系统症状，与小反刍兽疫、巴氏杆菌病以及绵 羊肺炎支原体羊肺炎等多种疫病症状相似，且临床表现多样、复杂，需要通过实验室诊断才能确 诊。由于Mccp 与丝状支原体簇其他成员关系密切，CCPP 准确诊断一直是本病防控的关键技术 难题之一，特异、敏感的诊断方法是研究工作中最具挑战性的一个方面。挖掘Mccp 特异性诊断 分子，进而建立准确、有效的诊断方法来研发诊断试剂，是有效防控CCPP 的技术支撑条件之一。 本研究主要通过两条途径挖掘CCPP 新诊断分子。途径一是通过比较基因组学方法，先筛选 得到Mccp 理论上特异的基因序列，然后，一方面优选潜在的特异性抗原基因序列87.1，利用原 核表达技术，获得该基因的重组蛋白，再通过WB 、iELISA 评估重组蛋白 87.1 的特异性和反应 原性，评价重组蛋白87.1 是否可作为CCPP 新的血清学诊断靶标；另一方面优选特异性基因序列 92.1，作为靶序列设计引物92.1F/R ，通过普通PCR 方法评估该引物的特异性，评价序列92.1 是 否可作为CCPP 新的核酸诊断靶标。途径二是以Mccp 以及与其亲缘关系较近的支原体作为抗原 筛选特异性单抗，经过小鼠免疫、杂交瘤细胞制备、细胞筛选、腹水制备纯化等单抗制备过程， 优选单抗7H11 作为指示抗体，通过建立阻断ELISA （bELISA ）方法评估该单抗的特异性以及应 用可能性，评价单抗7H11 是否可作为CCPP 新的血清学诊断分子。 结果表明：重组蛋白87.1 在WB 、iELISA 中与Mccp 阳性血清可发生反应，而且87.1-iELSIA 能够反映血清中Mccp 抗体水平的变化，不与丝状支原体山羊亚种（Mmc ）、山羊支原体山羊亚种 （Mcc ）阳性血清产生交叉反应，检测阴性血清时存在背景值偏高的现象，这表明重组蛋白87.1 可作为CCPP 新诊断靶标，但其使用条件还需优化。引物92.1F/R 在普通PCR 中，Mccp M1801 、 Mccp zly-14、Mccp M1601 、Mccp zly-1309F 作为模板时可扩增出509 bp 的目的条带，无乳支原 体(Ma) PG2 、Mmc PG3 、Mmc(原MmmLC) YG 、绵羊肺炎支原体(Mo) Y98 、Mcc CKid、牛支原 体(Mb) 08M、李奇氏支原体(Ml) PG50 作为模板时未扩增出条带，这表明序列92.1 可作为CCPP 新分子诊断靶标。在bELISA 体系中，单抗7H11 可检测出Mccp 阳性血清，与Mmc 、Mcc、Mo、 Ma 、Ml、Mb 阳性血清无交叉反应，但是在检测Mccp 人工感染山羊的后期血清时，出现假阴性 结果，所以7H11 是否可作为CCPP 新诊断分子候选，还有待进一步评估。 关键词：山羊传染性胸膜肺炎，特异性抗原，特异性核酸，特异性单抗，新诊断分子 I Abstract Contagious Caprine Pleuropneumonia is a severe respiratory disease caused by Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae (Mccp), which mainly affects goats and some wild ruminants, listed as one of the notifiable animal diseases by the World Organization for Animal Health (OIE). The epidemic area of CCPP covers more than 40 countries in Asia, the Middle East and Africa. The mai