第七章定点诱变.ppt

第七章 DNA定点诱变 Site-directed mutagenesis of cloned DNA ;突变是研究基因结构与功能的最基本的手段 经典的方法：分离自发突变体 用物理、化学诱变剂处理活体 诱变-整个生物体-目的基因上的突变极其有限 体外诱变(in vitro mutagenesis)：对克隆化的DNA进行诱变处理可得到经典诱变所能得到的所有种类的突变;突变方式: 定点诱变 随机诱变 易错PCR(error-prone PCR) DNA重排(DNA shuffling) 体外随机引发重组(random-priming in vitro recombination) 交错延伸(staggered extension process,StEP);突变类型: 单个碱基的置换 简单的插入或缺失 系统的缺失、插入或成串碱基的置换;第一节　 随机诱变 ;关键:①选择合适的突变频率 1.5-5bp/目的基因 有益突变 有害突变 ②根据研究目的对突变体进行定向选择或筛选,找到感兴趣的突变 颜色反应\水解反应\功能互补 定向进化(directed evolution):一次突变难以得到满意的结果,必须反复多次诱变和循环筛选 目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质;方法: 错误掺入诱变 盒式诱变(cassette mutagenesis) 增变菌株诱变 化学诱变;1.错误掺入诱变;易错 PCR（error-prone PCR）是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率,降低聚合酶固有的突变序列倾向性,提高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合适的载体克隆突变基因。 连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。 合适的DNA长度 1kb, 更长的扩增效率降低;方法： 增加MgCl2浓度到7mM,稳定非互补的碱基配对 增加聚合酶量到5U,促使在错配碱基处继续延伸反应 降低一种dNTP的量（降至1％-10％）.在缺乏正确核苷酸时,聚合酶经短暂停留后,会插入另外3种可用核苷酸的一种 加入次黄嘌呤dITP来代替被减少的dNTP,能与C、T、A配对 缓冲液中另加0.5mmol/L MnCl2, Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性 增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误掺入 使用突变DNA聚合酶如Mutazyme GC→AT;易错 PCR;2.盒式诱变(cassette mutagenesis);;;3.增变菌株诱变;将携带待突变目的基因的质粒导入增变菌株中扩增若干代,即可得到随机突变体库,再将该库的重组DNA转化到或亚克隆到正常宿主中筛选、鉴定突变体。 常用的大肠杆菌增变菌株：XL1-Red（mutD、mutS、mutT），随机突变频率10-3/（bp·代） mutD突变→DNA聚合酶Ⅲ的3’→5’外切活性缺陷，失去错配碱基的校正功能 mutS突变→DNA错配修复系统失去功能 mutT突变→不能水解dGTP的氧化产物8-oxodGTP， 8-oxodGTP在复制时掺入DNA中，造成突变;4.化学诱变;第二节　 DNA体外重组 ;一、DNA洗牌（DNA Shuffling）;DNA shuffling体外基因突变一般过程如下 (1)获得目的基因:选择一组分别具有一系列所需性状的基因序列作为重组的亲本,亲本之间有序列同源性(＞60%).亲本可以是经随机诱变得到的一组有益突变体,或天然存在的基因家族.常用的有两种方法。 为了增加突变率采用PCR扩增目的基因回收 为了增强保真性，可以采取抽提含有目的基因的质粒，通过酶切回收。 可以根据不同的需要任取其中一种方法。;(2)基因酶切回收:采用DNase I消化基因DNA得到10-50 bps或100-300 bps的片段，酶切过程中用Mn2+能提高保真性3倍左右。 (3)无引物PCR:切割的DNA片段通过相互间的同源随机互补并互为引物,经PCR扩增,获得大量随机组合的新DNA突变体.为确保得到高保真性的片段，应在较高的温度下复性。 同标准PCR,先对dsDNA进行热变性,退火时单链片段与足够长度互补序列的其它单链配对,形成3’或5’突出端,聚合酶延伸3’凹端.反复循环，随着循环数增加,片段的平均长度也增加,最后达到DNA亲本序列的原始长度.;(4)有引物PCR:将无引物PCR产物作适当稀释，作为模板进行PCR，加入特定两侧引物进行最后的PCR扩增,便可获得全长基因的PCR产