20201质粒DNA的提取酶切与电泳.pptVIP

实验题目 质粒 DNA 的提取、酶切与电泳 主讲： 生物实验教学中心 主要内容 前言 一、核酸分离、纯化原则 （一） 保持核酸分子一级结构的完整性 （二） 防止核酸的生物降解 二、分离提取核酸的主要步骤 （一） 细胞的破碎 （二） 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 （三） 核酸的沉淀 ( 四） 核酸的浓度测定 （五） 核酸的保存 核酸（ nucleic acid ） 是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 前 言 Home 一、核酸分离、纯化原则 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 1 意义 遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的 — 级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。 2 分离核酸原则： 1 ）温度 不要过高； 2 ） 控制一定的 pH 值 范围 (pH 值 5-9); 3 ） 保持一定的 离子强度 ; 4 ） 减少物理因素对核酸降解的 机械剪切力 . Home （二）防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温 灭菌 ，提取缓 冲液中需加 核酸酶抑制剂 。 1 DNA 酶抑制剂 1 ） 金属离子螯合剂： DNA 酶需要金属二价离子 Mg 2+ 、 Ca 2+ 的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制 DNA 酶活性。 如 EDTA-Na 2 ( 乙二胺四乙酸二钠 ) 、 8- 羟基喹啉； 2 ） 阴离于型表面活性剂： 如 SDS ，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。 2 RNA 酶（ RNAase) 抑制剂 RNAase 分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（ bentonite ） 作用机制： 皂土带负电荷，能 吸附 RNase ， 使其失活。 (2) DEPC( 二乙基焦碳酸盐 ) (C 2 H 5 OCOOCOOC 2 H 5 ) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制： 与蛋白质中 His 结合使蛋白变性。 使用注意： 1 ） DEPC 也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大 100 ～ 1000 倍。 2 ）容易降解，保存在 4 ℃ 或液氮中； 3 ）提 RNA 时， 0.1% DEPC 浸泡器皿 37 ℃ 2 h 。 4 ）剧毒 。 （ 3) 肝素 （ 4 ）复合硅酸盐（ Macaloid) （ 5 ） RNase 阻抑蛋白（ RNasin ） （ 6 ）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl- Ribonucleoside Complex, VRC) Home 二 分离提取核酸的主要步骤 （一）细胞的破碎 1 高速组织捣碎机捣碎 2 玻璃匀浆器匀浆 3 超声波处理法 4 液氮研磨法 5 化学处理法 (SDS 、 LDS ，吐温 80 等） 6 生化法（溶菌酶、纤维素酶等） Home （二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力 ( 核酸与碱性蛋白的结合 ) 、氢键和非 极性的范德华力。 分离核酸 最困难 的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 常用方法： 1 加入浓盐溶液（如 NaCl ） 核酸 - 蛋白质加入 NaCl 后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚； 2 加入 SDS SDS 除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能； 3 酚 / 氯仿抽提 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分