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从鸡蛋清中提取溶菌酶 制作者： 目录 1 、溶菌酶的含义 2 、溶菌酶的理化性质 3 、溶菌酶的提取及分离 4 、溶菌酶的用途 什么是溶菌酶 ？ 溶菌酶又称胞壁质酶或 N- 乙酰胞壁质 聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏 多糖的 碱性酶 。 溶菌酶的物理性质 ： 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶 于乙醚和丙酮， pI 为 11.0-11.35 ，最适 pH 值 6.5 。稳定性：酸性介质中可稳定 存在，碱性介质中易失活。存储条件为 2-8 摄氏度。 溶菌酶的化学性质： 溶菌酶的结构 一 : 【 实验目的 】 1. 熟练掌握离子层析分离纯化溶菌酶的原 理以及离子交换层析的操作方法 2. 理解 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶（ PAGE ）测 定蛋白质纯度与分子量的原理 二 : 【 实验原理 】 溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为 1,4- β -N- 溶 菌酶，又称作粘肽 N- 乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。 是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的 N- 乙酰氨基 葡萄糖与 N- 乙酰胞壁酸间的 β -1 ， 4 糖苷键，由 129 氨 基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基， 所以其等电点高达 10.8 左右，最适温度为 50 ℃，最适 PH 为 6 ～ 7 左右。 溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋 ( 含 量约为 2% ～ 4%) 和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来 源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质， 鸡蛋的 蛋清中含有丰富的上述物质，本实验以鸡蛋蛋清为原 料，对溶菌酶进行提取并分离纯化。 溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ， 在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时， 先采用等电点法粗分离，再用 DE-52 纤维素离子交换 色谱和葡聚糖 G50 凝胶层析分离纯化。 【 材料与仪器 】 鸡蛋 3 个 DE-52 纤维素 葡聚糖 G50 0.5*7cm 色谱柱、 2.5*20cm 色谱柱、烧 杯 (100ml,250mL ， 1000mL) 、锥形瓶 (100ml) 、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、 纱布、量筒（ 100mL,250 mL ， 1000 mL ）、 10 mL 离心管、 1.5mL Ep 管、高 速离心机、冰箱、电炉 【 试剂配制 】 冰醋酸、 5mol/L NaOH 、 20% 磺基水杨酸 溶液、 考马斯亮蓝染色液、 脱色液： 450mL 甲醇：水（ 1 ： 1 ）、 50mL 冰醋酸 、 0.02 mol/L PBS( pH8.0) 【 实验步骤 】 1. 溶菌酶的粗提取 （约两个半小时） 拿 3 个鸡蛋破壳取蛋清置于 250mL 烧杯中，轻轻 搅拌 5 分钟，使其的稠度均匀，然后用两层纱布 过滤，去除脐带和蛋壳。记录其体积 V1 加入 1.5 倍体积的 pH8.0 PBS 缓冲液，搅拌均匀 用冰醋酸调 pH4.7 左右，充分搅拌 3500rpm ，离心 20min 弃沉淀，转移上清至烧杯中 加入 1 倍体积的 pH8.0 PBS 缓冲液，搅拌 均匀，并用 5mol/L NaOH 调 pH8.0 滤纸过滤，取清液，测量并记录体积 V2 取清液装在 10mL 离心管中 -20 ℃冻存备用。（样品 S1 ） 2. 溶菌酶的分离纯化 （ 1 ） DE-52 初次纯化溶菌酶 ① DE-52 纤维素的处理 ②装柱 ③ 加样、洗脱 （ 2 ）葡聚糖 G50 再次纯化溶菌酶 ① 凝胶的处理 ② 装柱 ③ 加样、洗脱