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克隆质粒的复制子以及在宿主菌的拷贝数 质粒，其复制子以及在 E. coli 宿主内的拷贝数 质粒类型 复制子 拷贝数 pUC18 pMB1* 500-700 pKS(-) ColE1 300-500 pBBR1系列载体 pBBR1 30-40 pBAD322，pET等系列载体 pMB1-rop 15-20 pACYC系列载体 p15A 10-15 pSC101衍生载体 pSC101 5-10 ~15 (pir 宿主菌如 BW25141) pKD4, pR6KMCS R6K ~250 (pir-116 宿主菌如 BUN20) pJB866 RK2-trfA (oriV) medium opBADTcTypeG pMB1 120 copies at 37C pECBAC1 oriS 1~2 Genome One copy 拷贝数是指每个细胞中有多少个质粒 DNA的分子，质粒的拷贝数直接决定了 : 从菌液中获得质粒 DNA的量。拷贝数和量成正比关系 以之为载体时转化子的数目。拷贝数的高低和转化子的多少成正相关，是否线性不确切 3. 筛选用抗生素的浓度。拷贝数的高低和抗生素的使用浓度成正相关，如 100,g/ml 的氨苄 青霉素筛选 DH10B/pKS(-)，也可以用 50,g/ml;50,g/ml 筛选 DH10B/pBAD322;15,g/ml 筛选整合至基因组上的抗性基因。 当菌株的筛选和培养出现非预期的情形，适当地调整抗生素的浓度就非常重 要。 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 (Code:DV801A)  提到  4 ml 的过夜培养的菌液中可纯化得到  20 ,g  质粒，以此推断，  1.5ml  过夜培养含高 拷贝质粒如  pKS(-)  的菌液中可得到多于  5 ,g  质粒，如溶于  50 ,l TE/ddHO  ，则浓 度约  100ng/,l  。可参照此标准，来根据  2 不同拷贝数的质粒来推算本实验需要多少菌体、所提取质粒的量，再通过电泳 后与分子量标准的比较来进一步估算出的 DNA浓度。同样复制子的质粒，分子量较 大的质粒较分子量小的质粒所得到的量要略少。 以 pSC101-BAD-gbaA为例说明低拷贝质粒的试剂盒提取方法，采用 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit (DV801A) 。 o 挑取新鲜培养的抗性平板上的 3~5 个菌落至 5ml LB-3,g/ml Tc, 30C, 220rpm, 20h, 培养至溶液浑浊， 小量提取 ( 酶切鉴定及转化等 ): 1.5ml 毫升离心三次收集 4.5ml 的菌体至一个 EP管，按 Kit 方法进行质粒 提取 [2] 30,l 预热的 elution buffer 洗脱， 1,l 检测，适量酶切 2. 大量提取 ( 作载体或分离片段以构建克隆 ) o[1] 4ml 转接至 60ml LB- 3ug/ml Tc, 30C, 220rpm, ~8h,至溶液浑浊 2 个 30ml 分至 2 个 50ml 离心管， 5000rpm, 5min ，弃上清，再离心后，吸去残液。分 别以 800,l solution I 悬浮，每 200,l 分装至一个 EP管，按 Kit 方法进行质粒提取。 [3] 每两管溶液过一个吸附柱 ( 共四个 ) ，分别以 30,l 预热的 elution buffer 洗脱，合并体积 为 120,l ， 1,l 检测，适量酶切 上述两种方法均可通过真空干燥以减少体积同时增加浓度。