根系活力与过氧化物酶活性的测定.docx

根系活力与过氧化物酶活性的测定 丁丽喻若颖彭婵娟实验目的 掌握a -萘胺法测定根系活力? 观察重金属胁迫对根系活力的影响 . 掌握比色法测定过氧化物酶的活性的原理和步骤 . 实验原理 植物根系能氧化a -萘胺，可通过测定溶液中未被氧化的a -萘胺含量，定量测定根系活 力。 在有过氧化氢存在下， 过氧化物酶能使愈创木酚氧化， 生成茶褐色物质， 该物质在 470nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 OD70nm变化来测定其活性。 实验方法 a -萘胺法测定根系活力(萘胺氧化法) ⑴取50ug/ml a -萘胺和磷酸缓冲液各 25ml，于三角瓶混匀，须根系洗净吸干，取 1?2g浸 入三角瓶，取同样a -萘胺、磷酸缓冲液各 25ml于另一三角瓶，不放须根系作对照， 5分钟 后，两瓶各取2ml，按步骤3做第一次测定； ⑵将两三角瓶置于 25C恒温箱避光保存 60分钟后，各取2ml，按步骤3做第二次测定； ⑶取2ml培养液加10水混匀，再顺次加入 1ml对氨基苯磺酸与1ml亚硝酸钠，混匀观察颜 色变化，再定容至 25ml，室温25分钟，于510nm测OD直； ⑷作标准曲线：以 50ug/ml a -萘胺为母液，配液 40、30、20、10、5、0ug/ml溶液各10ml, 各取2ml，按步骤3分别反应，测OD直，以OD直为纵坐标、浓度为横坐标作标准曲线，计 算回归方程； ⑸分别查对标准曲线，或利用回归方程，计算出实验组与对照组实验前后对应的a -萘胺浓 度。 过氧化物酶活性的测定 (比色法 ) ⑴提取酶液 ⑵现配反应混合液，即 30mlpH6.0磷酸缓冲液加28ul愈创木酚加19ul双氧水(30% ⑶取2只比色杯，1只加3ml反应液和0.2ml磷酸缓冲液调零。另取一只加3ml反应液和0.2ml 酶液，立即计时开始测量。每隔 10s读数一次，直至 OD470nr 1.000 ⑷计算酶活性大小：过氧化物酶活性( u/g FW*min ) =△ A470*Vt/(W*Vs*0.01*t) 实验结果 1.根系活力测定 (gFW.h) a - 萘胺浓度 0 5 10 20 30 OD510nm 0.094 0.213 0.431 0.595 0.825 实验组 对照组 5 分钟后 60 分钟后 5 分钟后 60 分钟后 ODfi 0.385 0.292 0.383 0.415  a -萘胺浓度18.714.218.620.2a-萘胺浓度( a -萘胺浓度 18.7 14.2 18.6 20.2 a-萘胺浓度(ug/mL) 根系活力测定标准曲线 2.过氧化物酶活性 时间(s) 10 20 30 40 50 60 70 OD值 0.334 0.350 0.364 0.377 0.593 0.408 0.422 五误差分析 a -萘胺法测定根系活力 由于标准曲线是由其他组做的，其误差就不在此分析了 由公式 C?-萘胺=(C1-C2)-(C3-C4) 其中C1指实验组5分钟后a -萘胺浓度， C2指实验组60分钟后a -萘胺浓度 C3指对照组5分钟后a -萘胺浓度 C4指对照组60分钟后a -萘胺浓度 而由所得数据C3-C4为负值，可能是由人为误差或机器误差引起的。 误差有可能是以下原因： 仪器不干净；由于当时气温比较高， 所以没有在恒温箱中保存， 气温的变化也可能影响结果; 实验组和对照组也存在时间差；实验是小组三人一起配合的，也存在个人的操作误差。 过氧化物酶活性 首先是取材问题，由于是新鲜叶片，水分不可能完全擦干净，会存在误差； 其次离心后的上清液不可能完全转移； 另外酶保藏液解冻后可能未摇匀，或在测量前加底物与反应物的试管没有摇匀 还有两只比色杯由于不一样，肯定有误差； 并且10s后计一次数，也存在时间误差； 最后也是因为个人的操作误差和仪器的误差。