生物制药与药品检验技术 动手做：血清蛋白”大分家“--聚丙烯酰胺凝胶电泳分离猪血清蛋白 课件：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离猪血清蛋白.pptxVIP

;项目一 血清蛋白类药物的原料制备与分析检验;实训 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离猪血清蛋白;一、实训目的;二、实训意义;三、实训准备;试剂： 1. 30.8％胶母液：丙烯酰胺、N，N’-甲叉双丙烯酰胺 2. pH8.9分离胶缓冲液：Tris、1mol/L盐酸 3. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris、1mol/L盐酸 4. 10％（W/V）TEMED溶液 5. 10％（W/V）过硫酸铵溶液 6. 电极缓冲液的贮存液（pH8.3）：Tris 、甘氨酸 7. 电极缓冲液（pH8.3）：取贮存液稀释10倍 8. 40％（W/V）蔗糖溶液 9. 0.1％溴酚蓝指示剂 10. 固定液：50％甲醇、冰乙酸 11. 氨基黑 10B染色液：氨基黑10B 染料、乙酸 12. 脱色液：7％（V/V）乙酸;思考题： 1、配胶时，选择多少浓度的分离胶？分离胶的作用？ 2、分离胶灌注时，水封的目的？为什么？ 3、在蛋白质样品中加入蔗糖和溴酚蓝的作用？ 4、是否看懂表？两种胶的缓冲液pH一样吗？TEMED作用？ 5、 电泳需要在低温下进行吗？为什么？ 6、最接近正极的应该是哪种蛋白质？ 7、每一步的注意事项？哪些步骤是关键？;四、实训步骤;步骤一：装板;凝胶模子mould，3部分： 压成“ ”形的硅橡胶带； 两块长短不等的玻璃板； 样品槽模板。 玻璃板之间，0.5~2mm的间隙，胶灌入其中； 灌胶前，玻璃板洗净、晾干 ;步骤二：分离胶胶液的注入和聚合： 电泳槽、凝胶模子串成一体，垂直放置； 根据蛋白质相对分子质量范围，选择合适的分离胶浓度，按照表的试剂用量和加样顺序配制合适浓度的凝胶。 ; 试剂名称 /分离胶浓度;凝胶液沿着长玻璃板的内面缓缓倒入或用滴管滴入，不要产生气泡（为什么？）。到距玻璃板上沿2~3cm处为止； 注意：这一步要迅速！ 用滴管缓慢注入2cm的蒸馏水进行水封。 切忌：水呈滴状垂直下落（顶部的凝胶浓度变稀，改变预定的凝胶孔径，造成凝胶表面不平坦）;一层：分离胶;“漫长”的等待 水封后，静置，进行聚合反应，温度与电泳时相同（室温下）。10min开始聚合，40min左右完成。 刚加水时有界面，逐渐消失，等再出现时，表面凝胶已聚合，再静置30min，聚合完全。 ;分离胶无法聚合的原因;步骤三：浓缩胶胶液的注入和聚合： 用滴管吸去水封层，用无毛边的滤纸??吸去残留水液，滤纸尽量不要接触分离胶界面； 按比例混合浓缩胶，用滴管加到分离胶上方，距短玻璃板上缘0.2cm，把梳形样品槽模板轻轻插入胶液顶部； 静置，待出现明显界面表示聚合完成（30min左右）。 插入槽模板的目的：胶液聚合后，在顶部形成相互隔开的凹槽。电泳前，将样品液分别加在凹槽中。; 试剂名称 /分离胶浓度;步骤四：蛋白质样品的处理（临用前准备） 取10μL猪血清样品（盐析前、后），加5μL 40％蔗糖、5μL 0.1％溴酚蓝指示剂，混匀 加入蔗糖溶液：蔗糖，惰性，增大蛋白质的比重，防止样品在电泳过程中扩散； 加入溴酚蓝：指示，电泳过程中观察到样品的泳动 注意：液体很少，悬空加入迷你离心管！！！;步骤五：加样 剥去硅胶条，将板子固定于电泳槽 在两个“半槽”，即电极上槽（短板朝内）和下槽（长板朝外）内，分别加电极缓冲液，电极上槽，即铂金丝在上方的“半槽”内加的缓冲液必须高于铂金丝（没过短板）； 注意：缓冲液加满玻璃槽内即可；慢加，底部不要有气泡！ 用微量注射器依次在各个样品槽内加样 注意：不同样品的区分;加入蛋白质样品;步骤六：电泳 思考：样品先进入分离胶还是浓缩胶？ 上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪（仔细观察正负极的变化，比如冒泡了没？）； 样品进入浓缩胶前，电流15~20mA，持续约30~60min；进入分离胶后，电流20~30mA，保持不变 修改：电压300v，约电泳1~1.5 h（大板）； 电压220v，约电泳1.5 h（小板） 待指示染料迁移至下沿约0.5~1cm处停止电泳，需3~4h。;步骤七：染色 电泳结束后，将两块玻璃板剥开（针筒灌水“穿刺”），将胶取出，加入固定液固定30min； 弃去固定液，加入染色液，染色10min。;步骤八：脱色 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液； 一天换2~3次脱色液，直至凝胶的蓝黑色背景褪去、蛋白质色带清晰为止； 脱色时间一般约需一昼夜。;电泳结果;电泳结果;步骤九：绘图 分离后的血清蛋白条带，注明白蛋白和免疫球蛋白的位置;五、注意事项;六、安全提示;七、实训小结