蛋白纯化作业流程.docxVIP

蛋白纯化步骤 蛋白纯化步骤 走着，看着，身边小说是否能“联”到你生活里不经意间感慨； 听着，学着，那些零碎知识是否“联”到你科研里正在探索试验； ------ 知识公园里设计着一位主角，那棵树，笔直干、侧伸斜枝是思维框架，“联着”地下，伸向天空。科研思维总在不停地计划、设计，梳理知识，以备清楚行动。在设计步骤中不停吸收新知识，枝繁叶茂，丰富主干，正如条条大路通罗马，思维也会随之活跃，路也会愈加灵活。 现在天，我们所要梳理主干，是蛋白纯化知识步骤，即蛋白纯化基础策略，愿这些简单知识点归类能够联到你科研思维。 前奏：释放蛋白，目标：浓缩捕捉蛋白； 间奏：粗分离蛋白，关键利用离心、沉淀、萃取等方法将蛋白和细胞中其它成份（DNA、RNA等）物质进行分离。 主旋律：精细纯化蛋白，去除蛋白质分子量比较靠近蛋白和痕量杂质。 蛋白质纯化 蛋白质纯化 精纯化蛋白处理样品粗分离蛋白 精纯化蛋白 处理样品 粗分离蛋白 层析电泳离心沉淀法萃取、透析动物组织破碎植物材料研磨细菌破碎 层析 电泳 离心 沉淀法 萃取、透析 动物组织破碎 植物材料研磨 细菌破碎 等点聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳酶（纤维素酶、溶菌酶）超声波破碎电动、匀浆机破碎有机溶剂沉淀等电点沉淀盐析沉淀亲和层析凝胶过滤层析疏水层析离子交换层析 等点聚焦电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 酶（纤维素酶、溶菌酶） 超声波破碎 电动、匀浆机破碎 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 盐析沉淀 亲和层析 凝胶过滤层析 疏水层析 离子交换层析 我们需要依据目标蛋白质多种性质选择适宜蛋白纯化方法。 亲和层析因其高分辨率特点，常见于精制纯化蛋白，依据目标蛋白和配体之间特异性结合能力、重组标签蛋白螯合金属离子能力、带有糖基化修饰蛋白可于外源凝集素结合能力，亲和层析含有高目标蛋白分辨率，不过在进行精纯化蛋白之前，需要对蛋白质进行粗纯化，常见有硫酸铵盐析法。 比如分享来自一位网友纯化蛋白经验帖子，其目标在于纯化大肠杆菌表示可溶性sigma32蛋白，该蛋白能够和细胞内Core RNA polymeras结合形成复合体，最终确定采取免疫亲和柱来纯化蛋白复合体，但为了提升纯化效率，首先对复合体进行粗纯化，利用带正电PEI（聚乙烯亚胺）沉淀酸性蛋白和核酸，接着高盐洗脱蛋白，为了去除洗脱液中PEI溶剂，采取硫酸铵沉淀蛋白，将蛋白和PEI分开，粗分离纯化后，再采取免疫亲和柱方法进行精细纯化目标蛋白。 凝胶过滤层析能够应用蛋白分子间分级分离，也能够去除蛋白混合物中分子量差异较大杂质。比如从Hela细胞中纯化一个叫AP-1转录因子，就采取凝胶过滤方法去除混合物中核酸酶，因为核酸酶能够降解DNA亲和柱，并能够和其它非特异性蛋白结合，影响目标蛋白纯化。 在分离纯化蛋白时，因为其环境中PH值、有机溶剂、蛋白酶降解等不稳定原因影响，使得蛋白质分子间氢键、离子键、二硫键被破坏，影响蛋白稳定性，而有蛋白质对其所处缓冲液要求较高，比如，Stillman试验室纯化大肠杆菌表示CDC6蛋白，采取GST标签蛋白进行纯化，纯化得到CDC6不稳定而发生沉淀，以后试验了十多个buffer，结果发觉磷酸钾和谷氨酸钾缓冲液中，CDC6就不会沉淀并含有蛋白活性。 由此可见，每一个蛋白往往需要多个纯化方法精心组合才能达成分离纯化目标，而且需要仔细考虑试验过程中环境原因，确保纯化蛋白质稳定性。 在此篇文章中，我想提醒给大家是：知识联络和设计，将相关知识点串起来，同时给自己费心思了解知识穿上有个性外衣，这是基于你习性对于形式中理念了解，只要用心，我认为会是一件有意思事情。 另外，结合了部分进行蛋白质纯化试验中经验，肤浅分析了综合应用多种方法标准，每一个蛋白质全部有其对应氨基酸序列，表现出不一样理化性质，这些物理上差异性能够作为进行蛋白纯化线索，具体试验操作还需数次实践验证，愿这些基础知识能为你试验操作提供理论支持，试验中若有迷惑，能够给我发邮件（ ），我们企业北京义翘神州生物有专业蛋白表示纯化团体，多方探询，总能找到一点对您试验有利线索，若有需要请联络我。