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MM_FS_CNJ_01出口食品 副溶血性弧菌 微生物法 MM_FS_CNJ_0148 出口食品副溶血性弧菌检验方法 适用范围 本方法适用于海产食品中副溶血性弧菌检验，其他食品可参照使用。 主要试剂和仪器 . 主要试剂 30g/L 氯化钠稀释液：见； 60g/L 氯化钠蛋白胨水(PW):见； 氯化钠多粘菌素B肉汤(SPB):见； 硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂(TCBS):见； 氯化钠三糖铁琼脂 (TSI) :见； 嗜盐性试验用胰胨水(TB):见； 胰胨大豆琼脂斜面(TSA):见； 靛基质试验用培养基 (I) :见； 氨基酸试验用培养基:见； V-P 半固体琼脂(VP):见； 糖类分解试验用培养基:见； 42 C生长试验用培养基：见； O/F 试验用培养基(HLGB):见； 神奈川现象试验用我妻氏琼脂(WA):见。 . 仪器 试管：17mm 170mm 15mM 150mm 10mM 100mm 吸管: 1mL、 10mL； 培养皿:直径 90mm； 广口瓶或三角瓶； 电动均质器； 电动试管振荡器； 37 C恒温箱； 42 C恒温水浴箱； 试管架。 样品制备 .冷冻样品应在45C以下不超过15min或在2?5C不超过18h解冻。若不能及时 检验，应放于-15C左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验， 若不能 及时检验，应置于6?10C冰箱保存，在24h内检验。 . 取样:以无菌操作进行。 鱼类:取鱼体不同部位。 贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉； 如为带壳贝类， 则应先在清洁的流水中 洗刷净外壳，然后以无菌操作打开贝壳，取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。 甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。 . 以无菌操作称取 50g 检样放于均质杯中，以灭菌剪刀充分剪碎。 .加30g/L氯化钠稀释水450mL均质(8 000r/min)1min，使成1 : 10稀释液(如 无均质器，则应以剪刀尽量剪碎，加450mL稀释水使成1 : 10稀释液，并充分振 荡）。 .用1mL灭菌吸管吸取1 : 10稀释液1mL注入装有9mL 30g/L氯化钠稀释水的 试管内，振摇试管混合均匀，制成1 : 100稀释液。 .每一稀释度换取1支1mL灭菌吸管，按上项操作顺序进行10倍递增稀释。稀释 倍数要依据有关标准、规定、要求或样品污染情况而定。 增菌培养和分离 .对新鲜样品，可选择3个连续适宜的稀释度，分别以1mL无菌吸管各吸取1mL 稀释液，接种10mL单料氯化钠多粘菌素B肉汤中，进行选择性增菌培养，每一 稀释度接种3管（若选择的稀释度为接种1g样品时，则应以10mL灭菌吸管吸取 1 : 10稀释液10mL，接种10mL双料氯化钠多粘菌素B肉汤中）。 对经加热、辐射处理或冷藏、冻结的样品，可按以上操作先将样品接种于 60g/L氯化钠蛋白胨水于37C前增菌18?24h,然后将培养物以接种环转种到氯 化钠多粘菌素 B 肉汤中进行选择性增菌。 培养 18? 24h。 .氯化钠多粘菌素B肉汤管如有菌生长，则以3mmft径接种环分别取一环菌液， 划线于硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂 （TCBS）平板上。 培养 18? 24h。 .副溶血性弧菌在蔗糖琼脂（TCBS）平板上的典型菌落呈圆形，边缘整齐、湿润、 稍混浊、半透明，多数具尖心、斗笠状，蓝绿色菌落，直径 2? 4mm。 生化鉴定 .在蔗糖琼脂（TCBS）平板上如出现典型或可疑菌落，每个平板至少挑取两个菌落， 每个菌落分别顺次接种到下列培养基进行鉴别试验。 无盐胰胨水。 30g/L 氯化钠胰胨水。 氯化钠三糖铁琼脂：先穿刺后划线。 培养 18? 24h。 . 选取在氯化钠三糖铁斜面上产碱，在底层产酸，不产气，不产硫化氢；在无盐胰 胨水中几乎不生长；在 30g/L 氯化钠胰胨水中生长旺盛的菌株进行革兰氏染色、 镜检，副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，两端浓染、 无芽胞。如符合，继续进行以下生化鉴定。 嗜盐性试验：各取一环 30g/L 氯化钠胰胨水培养物，分别接种到 70g/L 及 100g/L氯化钠胰胨水中，37E培养18?24h。 细胞色素氧化酶试验： 取一环 30g/L 氯化钠胰胨水培养物划线到胰胨大豆琼 脂斜面上，37 r培养18?24h。 靛基质试验：在的 30g/L 氯化钠胰胨水培养物中加靛基质试剂后观察反应。 赖氨酸脱羧酶试验： 由氯化钠三糖铁斜面以接种针取少许培养物接种到赖氨 酸试验用培养基中，37 C培养18?24h。 精氨酸双水解酶试验： 按上项同样操作， 将培养物接种到精氨酸试验用培养 基中，37C培养18?24h。 V-P 试验：以接种针由氯化钠三糖铁斜面取少许培养物穿刺 V-P半固体琼脂， 37 r培养18?24h。在加V-P试剂前应先观察动力。沿穿刺线周围呈