木犀草素的抗胶质母细胞瘤作用及其机制研究.docxVIP

木犀草素的抗胶质母细胞瘤作用及其机制研究 胶质母细胞瘤是颅内肿瘤中最常见且恶性程度最高的恶性肿瘤 , 由于肿瘤高 度增殖、侵袭以及对放化疗的耐受性 , 患者即使接受最积极的治疗手段 , 患者依然 要面临手术疗效差、术后极易复发、生存期短的境地。因此 , 亟需我们开发新的 治疗药物 , 寻找有效的治疗方法。 木犀草素是一种天然黄酮类化合物 , 有文献报道其在体外、体内都有明确的 抗肿瘤作用。研究表明 , 肺癌中木犀草素是 Nrf2 的有效的和选择性抑制剂 , 能有 效抑制肺癌裸鼠种植瘤的生长并提高化疗药物的敏感性。 胰岛素样生长因子 (IGF-1) 在多种恶性肿瘤组织中高表达 , 其介导的信号通 路参与了肿瘤细胞凋亡调控。PI3K/AKT/mT0R言号通路的过度活化在肿瘤的发生 发展过程中具有十分重要的作用 ,与肿瘤细胞的恶性生物学行为侵袭 / 迁移、凋亡 和耐药等有着密不可分的关系。 内质网应激反应是细胞应对外界刺激的一种保护性反应 , 但是研究表明长时 间持续的内质网应激反应会诱导细胞发生凋亡。因此 , 本研究以胶质母细胞瘤细 胞系U251MGS U87M助体外模型,裸鼠皮下种植瘤为体内模型,详细研究木犀草 素的抗胶质母细胞瘤作用 , 其对胶质母细胞瘤侵袭 /迁移、凋亡的影响 , 以及对胶 质母细胞瘤替莫唑胺耐药细胞的作用,并研究IGF-1R/PI3K/AKT/mT0R通路以及 药物所引发的肿瘤细胞的内质网应激反应在这些过程中的作用。 本课题共分为以下五个研究部分 : 第一部分木犀草素对胶质母细胞瘤细胞迁 移的作用目的 : 研究木犀草素能否抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移。 方法:体外培养 胶质母细胞瘤细胞系U251MG口 U87MG接种于96孔,利用CCK-8进行细胞增殖实 验,将不同浓度梯度0,5,10,20,40,80卩mol/L的木犀草素处理细胞24h后用 CCK-8检测增殖,确定药物的给药浓度和时间(0,5,10,20卩mol/L,24h) 之后再检测对U251MG口 U87MGE移的影响；利用western blot 检测侵袭和 迁移相关蛋白 MMP-9,MMP-2,TIMP-1,TIMP-2的变化；利用westernblot 检测 EMT相关蛋白 Vimentin, B -catenin,N-cadherin 和 E-cadherin 水平变化；利 用罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞骨架蛋白 , 检测木犀草素对细胞形态和迁移表 型的影响。结果：细胞增殖实验结果显示木犀草素浓度小于 40卩mol/L时对肿瘤 细胞增殖没有明显影响 ； 细胞划痕迁移实验表明木犀草素能显著抑制胶质母细胞 瘤细胞的迁移；木犀草素能够明显下调侵袭和迁移相关蛋白 MMP-2,MMP-的表达 而上调抑制蛋白 TIMP-1,TIMP-2 的表达；此外木犀草素能够阻止胶质母细胞瘤细 胞的EMT过程。 结论： 木犀草素可以抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移。第二部分木犀草素对胶 质母细胞瘤细胞凋亡的影响目的 ： 确定木犀草素对胶质母细胞瘤细胞的凋亡的作 用。 方法：利用胶质母细胞瘤细胞系U251MG口 U87M(以及小鼠原代血管内皮细胞 模型，用不同浓度的木犀草素处理细胞，用CCK-8检测细胞活力确定其对肿瘤细 胞的杀伤作用 ； 通过 Annexin V 和 Propidium iodode(PI) 染色利用流式细胞仪检 测对胶质母细胞瘤细胞凋亡的影响。同时用 TUNEL染色、免疫荧光和western blot 检测 cleaved-caspase-3 的表达进一步确定其对肿瘤细胞凋亡的作用。 利用裸鼠皮下种植模型 , 检测木犀草素在体内的抗肿瘤作用 , 并用 western blot检测凋亡相关蛋白的表达，利用TUNE脸测肿瘤组织中的凋亡情况。结果： 我们发现木犀草素在40,80卩mol/L时在体外具有明显促进肿瘤细胞凋亡的作用 木犀草素能明显提高肿瘤细胞的 TUNE水平,cleaved-caspase3 的蛋白水平明显 升高; 木犀草素能通过促进凋亡抑制胶质母细胞瘤裸鼠皮下种植瘤的生长。 结论: 木犀草素能促进胶质母细胞瘤细胞的凋亡并抑制体内肿瘤生长。第三 部分内质网应激反应在木犀草素引发的胶质母细胞瘤细胞凋亡中的作用目的 : 明 确内质网应激反应是否参与了木犀草素引起的肿瘤的凋亡。 方法：利用荧光检测肿瘤细胞在药物刺激后 ROS勺水平情况,并利用western blot检测木犀草素(0,40,80卩M)作用24h后氧化应激相关蛋白Nf2、NQO-1 HO-1 的水平变化：利用western blot 检测40卩M木犀草素刺激不同时间 (0,1,3,6,12,24h) 及不同浓度(0,5,10,20 , 40,80卩M)作用24h后内质网应激反 应相关蛋白 p-