基因工程的常规技术ppt演示课件.ppt

第三节 基因工程的常规技术;一 凝胶电泳技术;影响琼脂糖凝胶电泳的因素：;琼脂糖凝胶电泳装置： ;琼脂糖凝胶电泳装置：;凝胶成像分析系统： ;DNA电泳图谱 ;重组子： 2.7 kb + 4.0 kb;聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原理示意图 ;SDS电泳图谱 ;1975，Edwen Southern提出分子印迹概念。 概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。目前主要应用于DNA，RNA，蛋白质的检测。;;核酸分子杂交的基本原理：; DNA-DNA 杂交双链分子;DNA印迹技术;Southern Blotting: Gel Transfer;;Southern blot;RNA印迹技术;酵母转化子Northern杂交结果;蛋白质免疫印迹法;原理：蛋白质组分经SDS分离后，平行转 移到固相支持体（NC膜或PVDF膜）上，通过免疫 试剂来检测靶蛋白。 靶蛋白的检测通常采用两步法或间接法，用一抗结 合靶蛋白，再用过氧化物酶（HRP）标记的二抗 结合一抗，然后HRP催化化学显色反应或化学发 光反应。;;三 PCR技术;PCR技术的创建;Kary B. Mullis（1944－）;;PCR技术的基本原理;PCR扩增原理;Polymerase Chain Reaction (PCR);引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-30 bp为宜（17 1.5×1010bp）。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。; 总体积 50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物（0.1-0.5 ?mol/L） DNA分子 模板 （50-100ng ） Taq酶 DNA聚合酶（0.5-2.5 U/50 ?L ） ;经典循环参数：;用途广泛：;四 基因文库构建;;基因文库构建的基本战略;基因文库的构建程序;●基因组DNA的切割;●载体和受体的选择;●从基因文库中筛选目的基因;;作业：