纳米磁珠介导牡丹花粉转基因技术的研究.pdf

摘要 摘要 牡丹(Paeonia Sect.Moutan）遗传背景复杂，通过杂交育种培育一个新品种至少 需要10 余年时间，包括转基因育种在内的分子育种将成为牡丹遗传改良的主要发展 方向。然而，牡丹组织离体再生困难，至今尚未建立成熟的遗传转化技术体系。因此， 探索一种简单、快速、有效的遗传转化新方法对牡丹育种具有重要意义。 本研究采用四氧化三铁纳米磁珠转化方法，首次进行了花粉介导牡丹转基因的研 究，选用磁性纳米颗粒 （Magneticnanoparticles，MNPs）polyMAG100 为基因载体， 构建不同质量比的纳米载体-基因复合物；通过琼脂糖凝胶电泳阻滞试验分析 polyMAG100 与DNA 的结合能力以及保护DNA 免受消化酶降解的能力；利用MNPs 吸附质粒DNA，在磁场的作用下，将FT-EPSPS 目的基因导入花粉，通过离体培养 研究磁转染处理对花粉活力的影响；研究牡丹三个杂交组合FI代植株对草甘膦盐溶 液的敏感性，及对潮霉素溶液的抗性，探究得出适宜牡丹的筛选体系；对初步筛选出 的抗性种苗进行外源基因分子检测，分析其在牡丹基因组中的整合情况。所得结论如 下： 1polyMAG100 与DNA 的质量比为1:1-1:10 时，能够与DNA 稳定结合，并能保 护DNA 免受酶的消化作用，是一种较为理想的基因载体。 2 磁转染 ‘凤丹’、 ‘京红’以及实生紫斑牡丹三种牡丹的花粉，萌发率依然 保持在50%以上，与未处理的花粉相当，说明磁转染处理对花粉没有造成明显损伤。 3草甘膦盐溶液处理植株叶片受害的程度，随着处理浓度增加有所加重，在溶液 浓度比例为1:100-1:25 的范围内，经处理地块的杂草全部死亡，但牡丹叶片只是尖部 有所干枯；当溶液浓度比例增加到1:5 时，牡丹叶片干枯、变黄受害现象明显，易于 分辨。 4 在经2200mg/ml 的潮霉素溶液筛选后，挑选无明显叶色反应的抗性植株进行分 子检测，共筛选出22 株转基因PCR 阳性幼苗。 本实验采取了花粉介导牡丹转基因的全新研究方法，在后续研究工作中可综合运 用CRISPR-Cas9 分子技术，培育牡丹优质新品种，加快推动牡丹分子育种事业的进 程。 关键词：牡丹，磁性纳米颗粒，花粉介导，遗传转化 I 目录 目录 1 引言 1 1.1 植物基因工程育种1 1.1.1 农杆菌转化法1 1.1.2 基因枪转化法1 1.1.3 电击转化法2 1.1.4 超声波介导法2 1.1.5 花粉管通道导入法2 1.2 纳米基因载体3 1.2.1 纳米颗粒的表面修饰3 1.2.2 磁性纳米基因载体3 1.2.3 磁性纳米基因载体应用于植物转基因的研究4 1.3 抗性筛选体系5 1.3.1 草甘膦的理化性质和作用机制5 1.3.2 潮霉素B 的作用机制8 1.3.3 其他常用筛选剂的作用机制9 1.4 本研究的目的意义、内容和技术路线10 1.4.1 研究的目的、意义10 1.4.2 研究内容及技术路线11 2 表达载体的构建与花粉观察13 2.1 试验材料13 2.1.1 试剂13 2.1.2 材料13 2.1.3 主要仪器13 2.1.4 引物设计13 2.2 试验方法14 2.2.1 pCAMBIA1301-FT表达载体的构建14 2.2.2 pCAMBIA1301-FT-EPSPS表达载体的构建15 2.2.3 MNPs/DNA复合物的构建16 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳阻滞实验16 2.2.5 花粉扫描电子显微镜观测