╲t高效毛细管电泳.ppt

2020/4/7 仪器 3 2020/4/7 二、仪器流程与主要部件 process and main assembly ? 电压： 0 ～ 30kV ； ? 分离柱不涂敷任何固定液； ? 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到： 10 -19 ～ 10 -21 mol/L ） 2020/4/7 1. 高压电源 （ 1 ） 0 ～ 30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （ 2 ）具有恒压、恒流、恒功率输出； （ 3 ）电场强度程序控制系统； （ 4 ）电压稳定性： 0.1% ； （ 5 ）电源极性易转换； 2. 毛细管柱 （ 1 ）材料：石英：各项 性能好；玻璃：光学、机 械性能差； （ 2 ）规格：内径 20 ～ 75 μ m ，外径 350 ～ 400 μ m ； 长度 =1m 2020/4/7 3. 缓冲液池 化学惰性，机械稳定性好； 4. 检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化； 类型 检测限 /mol 特点 紫外 - 可见 10 -13 ～ 10 -15 加二极管阵列，光谱信息 荧光 10 -15 ～ 10 -17 灵敏度高，样品需衍生 激光诱导荧光 10 -18 ～ 10 -20 灵敏度极高，样品需衍生 电导 10 -18 ～ 10 -19 离子灵敏，需专用的装置； 2020/4/7 三、毛细管电泳的进样方式 injection method of HPCE 进样量：毛细管长度的 1%-2% ；纳升级、非常小； 1. 流体力学进样方式 （ 1 ）进样端加压 （ 2 ）出口端抽真空 （ 3 ）虹吸进样 t L Pd ? 128 π 4 ? ? 进样体积 2020/4/7 毛细管一端插入样品瓶，加电压； 2. 电动进样方式 t L ct r V ef eo 2 π ) ? ? ? ? （ 进样量 进样不均 ：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样 量大； 离子丢失 ：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不 去； 特别适合黏度大的试样 ； 3. 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。 2020/4/7 第四节 高效毛细管电泳分离模式 2020/4/7 分离类型 八种分离类型，介绍常用的几种； 根据试样性质不同，采用不同的分离类型； 每种机理的选择性不同； 2020/4/7 一、毛细管区带电泳 capillary zone electrophoresis ， CZE 带电粒子的迁移速度 = 电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子 ：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子 ：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流 出； 阴离子 ：两种效应的运动方向 相反； ν 电渗流 ν 电泳 时 , 阴离子在 负极最后流出 , 在这种情况下 , 不但 可以按类分离 , 同种类离子由于 差 速迁移 被相互分离。 最基本、应用广的分离模式； 2020/4/7 二、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ， CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分 离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、 DNA 等的电荷 / 质量比与分子大小无关， CZE 模 式很难分离，采用 CGE 能获得良好分离， DAN 排序的重要手段。 特点 ：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术 ：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘 度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。 2020/4/7 1. 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界 浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 三、 胶束电动毛细管色谱（ MECC ， MEKC ） Micellar electrokinetic capillary chromatography ， MEKC 在电场力的作 用下，胶束在柱中 移动。 2020/4/7 2. 电泳流和电渗流的方向相反，且 ν 电渗流 ν 电泳 ， 负电胶束以较慢的速度向负极移动； 5. 色谱与电泳分离模式 的结合。 3. 中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性 强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； 4. 可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应 用范围 ； 2020/4/7 1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； 2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范 围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（ 6 ～ 8V ） 时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的 pH 梯度； 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液 pH 有关， 在酸性溶液中带