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微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞 结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细 菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony ）。不同微生物在某种培养 基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却 有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是 微生物检验鉴别中的一项重要内容。 　　１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色 素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液 体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、 扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌 的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形 成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基 表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心， 正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在 固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。 二、生理生化试验 　　微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在 形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之 一。 　　微生物检验中常用的生化反应有： １、糖酵解试验 　　不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气 或不产气。可用指示剂及发酵管检验。 　　试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管， 若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置 36±1.0°C 培养，每天观察结果， 检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固 体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若 有动力、培养物可呈弥散生长。 　　本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别， 因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和 An-drade 指示剂。 ２、淀粉水解试验 　　某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不 再变蓝色。 　　试验方法：以 18~24h 的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区 接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于 36±1°C 培养 24~48h ，或于20°培养 5 天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立 即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色 透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。 　　淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养 基含有淀粉量和 pH 等均有一定关系。培养基 pH 必须为中性或微酸性，以 pH7.2 最适。淀 粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。 某些细菌能够分泌淀粉酶（胞外酶），将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌 吸收利用。淀粉被水解后遇碘不再变蓝色。 （1）将装有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化，然后取出冷却至50℃左右， 即倾入培养皿中，待凝固后制成平板。 　　（2）翻转平板使底皿背面向上，用记号笔在其背面玻璃上划成两半，一半 用于接种枯草芽孢杆菌作为阳性对照菌，另一半用于接种试验菌大肠杆菌或产气 肠杆菌。接种时用接种环取少量菌在平板两边各划 “+”字。如图 7-1-1。 　　（3）将接完种的平板倒置于37℃恒温箱中，培养24h。 （4 ）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘 液均匀铺满整个平板。如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。透明 圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。 ３、V-P 试验 　　某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合， 脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二