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简便快速的 PCR 技术 依赖核酸序列的扩增技术 (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification ； NASBA) ? 反应体系： 缓冲溶液 AMV 逆转录酶 T7 RNA 聚合酶 RNase H 引物 ( 下游引物 5 端带有 T7RNA 聚合酶 启动子序列 ) 。 依赖核酸序列的扩增技术 (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification ； NASBA) 原理： ? 靶 RNA 经 AMV 逆转录，形成 RNA:DNA 杂交体 ? RNase H 降解杂交体的 RNA ，剩下单链 DNA ? AMV 以其为模板 , 合成含 T7RNA 聚合酶启动子的 双链 DNA ? T7RNA 聚合酶以其不断转录出靶 RNA ? 进入新一轮扩增循环 ? 产物主要为反义单链 RNA 、 RNA:DNA 杂交体和 双链 DNA 。 依赖核酸序列的扩增技术 (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification ； NASBA) 特点： ? 可直接扩增特异性单链 RNA ? 整个反应不需 PCR 仪，无需温度循环，没 有高温变性步骤，不会受到外来双链 DNA 的污染。 ? 反应速度快，忠实性好，特异性强，敏感 性高。 ? 加入变性步骤， 也能扩增双链 DNA 。 环介导等温扩增技术 (loop 一 mediated isothermal amplification ， LAMP) 反应体系 : ? 缓冲液 ? 具有链置换特性的 DNA 聚合酶 ? dNTP ? 模板 DNA ? 能够识别靶 DNA 6 个特异序列的 4 条引物。 引物为 2 条内引物和 2 条外引物 环介导等温扩增技术 (loop 一 mediated isothermal amplification ， LAMP) 哑铃状模板合成阶段 ? 引物 FIP 首先和 F2c 结合启动互补链的合成，形成 双链结构 ( 图 1b) 。 ? F3 再和 F3c 结合，启动链置换反应，释放出 1 条 FIP 连接的互补链，在其一端能够形成环状结构 ( 图 1d) 。 ? 这条单链 DNA ，又可作为模板，在另一端分别结 合 BIP 和 B3 ，合成 1 条双链，并置换出 1 条哑铃状的 DNA( 图 1f) 。 ? 哑铃结构很快与其一端 F1c 和 F1 互补，而由自我引 物延伸机制合成 1 种双链的茎环结构 DNA( 图 1g) 。 这种茎环结构的双链 DNA 是循环反应的原料。 循环反应阶段 ? FIP 和双链茎环结构 DNA( 图 Ig) 中的环状结构结合，形成 1 种有缺口的过渡性茎环结构 DNA ，该结构在茎上含有靶 序列的 1 个额外反向复制序列，在对面的末端，通过 BIP 形成 1 个环状结构。 ? 在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下， 开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐增加，最后的 产物为茎环 DNA 组成的混合物，即含有若干倍茎长度茎 环结构和类似花椰菜的结构 ( 含有在同一链上由退火形成 的，在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构 ) 。 环介导等温扩增技术 (loop 一 mediated isothermal amplification ， LAMP) 扩增结果判定：有 3 种判定方法 ? 1 、琼脂糖电泳后，用 EB 或 SYBR Green I 染色检 测。 ? 2 、产物中加入 M g + 试剂，肉眼观测副产物焦磷 酸镁沉淀：阳性 - 液体浑浊， 静置有白色沉淀。 ? 3 、产物中加 SYBR Green Ⅰ ， 肉眼观察颜色反应： 绿色阳性， 橙红色阴性。