酵母蔗糖酶的的提取及其性质研究.pptVIP

酵母蔗糖酶的提取及其性质研究 1、学习酶的纯化方法,酶蛋白分离提纯的原理。 2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层 析技术。 本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会,学 习如何提取纯化、分析鉴定一种酶,并对这种酶的性 质,尤其是动力学性质作初步的研究。 Evaluauon onr. ch Asposeslides for NET 4o dient P Evaluation only. Created with Aspose Slides for NET 4.0 dient Profilo 71 Copyright 2004-2017Aspose Pty L 实验原理 自1860年 Bertholet从啤酒酵母( Saccharomyces Cerevisiae)中发现了蔗糖酶以来,它已被广泛地进行了研究 蔗糖酶( invertase)(β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶) (EC32.1.26)特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解, 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催 化棉子糖水解,生成蜜二糖和果糖 Evaluauon onr. ch Asposeslides for NET 4o dient P Evaluation only. Created with Aspose Slides for NET 4.0 dient Profilo 71 Copyright 2004-2017Aspose Pty L 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵 母细胞膜的外侧和内侧,在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶, 其活力占蔗糖酶活力的大部分,是含有50%糖成分的糖蛋白 在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶,含有少量的糖。两种 酶的蛋白质部分均为双亚基,二聚体,两种形式的酶的氨基酸组 成不同,外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸,Ser和Met,它们 的分子量也不同,外酶约为27万(或22万,与酵母的来源有关) 内酶约为135万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别,但其 底物专一性和动力学性质仍十分相似,因此,本实验未区分内酶 与外酶,而且由于内酶含量很少,极难提取,本实验提取纯化的 主要是外酶 Evaluauon onr. ch Asposeslides for NET 4o dient P Evaluation only. Created with Aspose Slides for NET 4.0 dient Profilo 71 Copyright 2004-2017Aspose Pty L 两种酶的性质对照表如下 名称MW糖含量亚基为蔗糖的κm为棉子糖的KmpⅠ最适pH稳定pH最适温度 外酶27万50%双26mM 150mM 5.04.93.0-7.560°C 内酶13.5万3%双 25mM 50 mM 5.04.56.0-9.060°C 实验中,用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗 糖水解的速度,在给定的实验条件下,每分钟水解底物的量 定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位 Evaluauon onr. ch Asposeslides for NET 4o dient P Evaluation only. Created with Aspose Slides for NET 4.0 dient Profilo 71 Copyright 2004-2017Aspose Pty L 本实验共有三个分实验: 蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 Evaluauon onr. ch Asposeslides for NET 4o dient P Evaluation only. Created with Aspose Slides for NET 4.0 dient Profilo 71 Copyright 2004-2017Aspose Pty L (一)蔗糖酶的提取与部分纯化 细胞破壁的几种方法 高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒 盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。 2、玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上 下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用 于量少和动物脏器组织 3、反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细 胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。 4、超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破 裂,此法多适用于微生物材料。 5、化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠 sDs)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌