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枇杷叶内生菌菌种内细菌的分离培养与鉴定 (终) 枇杷叶内生细菌 [摘要 ] 中细菌的分离、培养和鉴定目的 :培养和鉴定三种不同来源的枇杷叶内生细菌 方法 :将枇杷叶去皮，研钵研磨，得到组织提取物，用稀释法培养 叶内内生细菌中的细菌， 最后用单一染色法染色， 用显微镜观察法观察细菌结果 :培养皿中菌落形态呈现不同特征 结论 :枇杷叶内生细菌中不同细菌的数量和数量存在显著差异。 [关键词 ]枇杷内生细菌多样性 1 引种 : 枇杷 :蔷薇科枇杷，其花、果、叶、根均可入药，具有清肺降气、化痰的功效该果实酸甜可口，性凉，具有清肺润肺、止咳平喘、和胃止渴、降气止呕、温上润肺的功效。我国已开发出多种枇杷制剂，如李强枇杷糖浆，并因其多重功效而广泛应用于临床医学。因此，我们 对枇杷内生细菌的培养和分离进行了初步研究 2 实验部分 :2.1 材料 新鲜绿色枇杷叶 (采自浙江工业大学下沙校区白草花园 4 种不同枇杷树 )原植物鉴定为枇杷牛肉膏蛋白胨固体培养基 (用于培养 )、牛肉膏蛋白胨固体培养基 +制霉菌素 (用于细菌筛选 )2.2 操作方法 : 2.2.1 内生细菌的分离 :用自来水清洗新鲜植物表面，用 1000 毫升 95%的酒精浸泡 3-5 分钟，然后用无菌水冲洗 3-4 次，放在超净的桌 子上备用用研钵研磨枇杷叶， 加入适量无菌水， 然后用 1 毫升移液管 将 10 毫升原液吸入一个有盖的空试管，标签为①用稀释法将原液稀 释至含 9 毫升无菌水的试管的 10-1 ~ 10-5 倍，制成 10 毫升溶液，分别标记为② ~ ⑥，得到梯度样品溶液，并保存在超净的工作台上。 在超净工作台上，用 200 微升移液器将上述 6 管样品液分别转移至 6 个灌注板中的每一个 200 微升，分别涂上酒精灯，相应编号，标记稀释倍数、日期和组，并在 26℃培养箱中倒置培养 3-5 天 2.2.2 内生细菌的鉴定 :从培养皿中分离的细菌中分别筛选出 5 个菌斑，分别用单 一染色法进行染色。然后观察和鉴定染色细菌的显微形态特征。 2.3 操作过程 :2.3.1 样品制备溶液 (1)放在超净台上，用研钵研磨早期放置的枇杷叶，用无菌水溶解， 用纱布过滤，得到样品溶液备用 (2)使用 1 毫升移液管从装有样品溶液的烧杯中吸取 1 毫升，并将其注入已经装有 9 毫升无菌水的试管中， 并将其充分混合均匀， 编号②然后，用 1 毫升移液管从 2 号试管中吸取 1 毫升样品溶液， 并将其注入另一个装有 9 毫升无菌水的 2 号试管中以此类推， 分别配制稀释 10-3 ~ 10-5 倍的各种样品液，并分别编号为③ ~ ⑥。 2.3.2 微生物分离的涂布板方法 (1)倒置板 :当牛肉膏蛋白胨琼脂培养基冷却至 55-60℃时，向其中加 入 0.6 毫升 (50 微克 /毫升 )制霉菌素。倒置板。 方法 :右手拿一个装有培养基的锥形瓶， 放在火焰旁边 5-10 厘米的 地方。左手用手掌边和 小手指控制培养皿，将锥形瓶口对着火焰消毒，然后左手在靠近 火焰的培养皿盖上开一条缝，迅速倒入约 15 毫升的培养基，盖上培 养基，然后将培养基放在桌面上，浓缩后形成平板。 (2)涂膜 :用记号笔分别用 1-10-56 倍稀释液书写培养基。之后，用 200 微升移液器分别从 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 倍稀释液中取 出 200 微升对，并将其放入写有稀释度的平板中，然后将 0.2 毫升储 备溶液吸入 1 倍的培养基中。培养基表面用无菌玻璃涂布棒轻轻均匀 涂布。 (3)培养 :将牛肉膏蛋白胨板在 26OC 培养箱中倒置 3-5 天。 2.3.3 观察 :几天后做观察记录。分离的细菌用单一染色法染色，然 后在显微镜下检查。 细菌单一染色法 : 1，涂片 :取两块干净的载玻片，每滴生理盐水置于载玻片中心，分 别挑取 细菌，无菌培养，涂于载玻片生理盐水中，使细菌悬液在载玻片 上形成均匀的膜 (每种细菌一片 )。 2，干燥 :室温自然干燥 3，固定 :涂层表面朝上，通过火焰 2-3 次，使细胞质固化，从而固 定 ，固定细菌形态，防止细菌轻易脱落。 4，染色 :水平放置载玻片，将染色液滴在涂膜上，将番红染色液染 色 1-2 分钟 5，水洗 :倒出染料溶液，用自来水洗涤用吸水纸吸收多余的水分， 自然晾干。结果 2.4: 2.4.1 3 天后观察 :在 5 种培养基中， 10-1 号培养基有单个菌落，具 有小、黄、湿、圆、凸起、不透明、边缘整齐等特点，其余培养基均 无菌产生。一周后 :在 5 种培养基中， 10-1 号培养基具有单一菌落， 表现出大、黄、湿、圆、凸起、不透明、边缘整齐等特征。而其余的 培养基是无菌产生的。 两周后，在五种培养基中的第 10-1 号和第 10-2 号培养