碱性蛋白酶高产菌株的诱变选育.pdf

摘要 摘 要 碱性蛋白酶指在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶，最适pH 在9～11之 间。其活性中心大都含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶。广泛应用于洗涤剂、食品、 丝绸、制革、医疗等行业。目前，国外大公司垄断着蛋白酶制剂品，国内企业有 生产但是酶产量低、价格昂贵、酶学性质不理想等问题使企业盈利低，因此，如 何提高菌株的产酶能力和发酵条件的优化依然是研究的热点问题。 本实验以河南仰韶生化工程有限公司的2709 碱性蛋白酶菌株为研究对象， 利用多种诱变方法选育出高产菌株，研究其酶学性质，并进行工艺优化。 1. 选育碱性蛋白酶高产菌株 2709 Y9 15582 U/mL 从碱性蛋白酶菌株 分离出一株产酶稳定的菌株 （ ）。 对菌株Y9 进行了诱变选育，结果发现，当紫外线为30 W，距离20 cm 时，诱 变60 s，正突变率较高；利用硫酸二乙酯与紫外线对菌株进行复合诱变，用浓度 1.5%的硫酸二乙酯处理30 min 后进行紫外诱变；又利用常压室温等离子体诱变 技术对菌株进行诱变，气源用氩气，功率为 100W，诱变时间为70 s 时，正突 变率较高。菌株用多种诱变方法反复诱变，最后获得一株碱性蛋白酶高产菌株 A59，其酶活为23485U/mL，通过遗传稳定性分析，发现遗传稳定性较好。该 菌株与出发菌株相比，酶活提高了50.72%。 2. 碱性蛋白酶酶学性质的研究 对菌株A59 所产碱性蛋白酶进行酶学性质的初步研究。结果发现，该酶的 最适作用温度为55～60℃；酶的最适作用pH 为9～11；温度在45℃以下时，酶 具有良好的热稳定性；pH 在8～10.5 之间时，具有较好的pH 稳定性和耐碱性； 1mol/L H O Ca2+ Mn2+ 该酶对 的 2 2 具有较强的抗氧化性； 、 可稍微提高酶活， 2+ 2+ 2+ + + Fe 、Zn 几乎完全抑制酶反应，Mg 、Na 、K 对酶活无明显影响。通过酶学 性质研究，发现该菌株与出发菌株的酶学性质几乎一致，说明该菌株的酶成分几 乎没有什么改变。 3. 碱性蛋白酶高产菌株发酵工艺的研究 以菌株A59 为研究对象，通过对影响该菌株的9 个因素进行研究，结果发 3.6% 5.2% 0.8% Mg2+ 0.15% 现，当豆粕粉 、玉米粉 、磷酸氢二钠浓度 、 浓度 、吐 温-80 浓度0.12%、接种量5%时，酶活为36829 U/mL。在这些因素中，影响产 2+ 酶最显著的因素是Na HPO 浓度、Mg 浓度、吐温-80 浓度。对这些因素进行3 2 4 5 Na HPO 0.9115% Mg2+ 因素 水平的响应面试验，结果发现，当 2 4 浓度 、 浓度 0.1593%、吐温-80 浓度0.09%时，菌株的预测酶活达到38758.626 U/mL。该条 I 摘要 件下，通过进一步验证，酶活为38650U/mL，提高了64.57%。通过对菌株A59 进行发酵动力学分析可知，培养到42 h，菌株的酶产量到最高值38650 U/mL， 比出发菌株发酵时间提前了4h 左右。 4