自噬在单增李斯特菌抗小鼠黑色素瘤中的作用及机制研究.pdfVIP

摘要 摘 要 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes ，LM ）作为新颖的肿瘤疫苗载体之一， 在肿瘤治疗中具有较好的应用前景。虽已证实LM 具有非特异性抗肿瘤作用，但 其机制仍不十分清楚。自噬是一种重要的细胞保护机制，是机体抵御病原入侵的 第二道防线，研究发现自噬在肿瘤发生发展中具有重要作用。前期研究表明 LM 能够诱导小鼠黑色素瘤细胞B16F10 发生自噬和死亡，那么自噬在LM 抗肿瘤中 发挥什么样的作用呢？因此，我们以LM 感染小鼠黑色素瘤细胞B16F10 和小鼠 肿瘤模型为研究对象，从体内外阐明自噬对LM 诱导肿瘤细胞死亡的影响，有助 于揭示LM 抗肿瘤作用的新机制。主要内容如下： 1．LM 诱导小鼠黑色素瘤细胞B16F10 自噬的发生 将LM 感染B16F10 肿瘤细胞后，通过RT-PCR 检测自噬基因mRNA 表达水 平，Western blot 技术检测自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 的比值变化，利用透射电镜和 自噬LC3 双标腺病毒观察细胞内的自噬现象。结果显示，与对照组相比，LM 感 染后，B16F10 肿瘤细胞内ATG12 ，ATG7 ，ATG5 ，ATG3 以及Beclin-1 基因的 mRNA 相对表达水平增加，且在感染后4 h 达到高峰，此时ATG3 、ATG5 、ATG7 、 ATG12 、Beclin-1 分别增加了 223% ，352% ，158%，142%，379% ，P62 下降了 45% ，差异均具有统计学意义 （p 0.01 ）；Western blot 结果发现，LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ 比值在LM 感染后2 h ，4 h ，6 h ，8 h 分别增加了122.05%，174%，280.01% ，96.68% ， 差异均具有统计学意义 （p 0.01 ）；透射电镜以及自噬LC3 双标腺病毒检测发现， 细胞中自噬小体数量显著高于对照组。以上结果表明，LM 感染B16F10 肿瘤细胞 后通过调控细胞内自噬标志物的表达水平，可诱导B16F10 肿瘤细胞自噬的发生。 2 ．稳定沉默自噬调控基因Beclin-1 的B16F10 细胞株的构建及鉴定 采用RNA 干扰技术沉默小鼠黑色素瘤细胞B16F10 的Beclin-l 基因表达，构 建稳定的Beclin-l 基因沉默的B16F10 细胞系。设计并合成3 种靶向小鼠Beclin-l mRNA 的shRNA 及阴性对照 shRNA ，分别插入质粒HBLV ，重组质粒分别命名 为 m-shRNA1-Beclin-1、m-shRNA2-Beclin-1、m-shRNA3-Beclin-1 及 m-con-sh 。 将重组质粒在293T 细胞内经慢病毒包装后感染B16F10 细胞，应用嘌呤霉素筛选， 采用RT-PCR 检测细胞Beclin-l mRNA 表达，筛选出沉默效率最高的细胞。采用 免疫荧光技术及Western blot 方法分别检测病毒感染细胞Beclin-l 蛋白和LC3 蛋 白表达。重组质粒经测序证实 shRNA 序列符合预期；m-shRNA1-Beclin-1、 m-shRNA2-Beclin-1、m-shRNA3-Beclin-1 转染B16F10 细胞后，Beclin-l mRNA 表 达抑制率分别为75%、71%、74% ，差异均具有统计学意义 （p 0.01 ），因此选取 I 摘要 抑制率最高的 m-shRNA1-Beclin-1 用于后续试验研究。蛋白免疫荧光检测发现 siRNA 能够有效降低Beclin-1 的蛋白表达量；Western blot 结果表明，与对照组细 胞相比，B16F10-m-Beclin-1-shRNA1 细胞 LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ 比值降低了 117.93% （p 0.01 ）。以上结果表明，成功建立Beclin-l 基因沉默的B16F10 细胞株，并且 证明干扰Beclinl-1 表达能够有效抑制B16F10 细胞自噬的发生。为探讨自噬在LM 抗小鼠黑色素瘤中的作