汇总资料cho细胞蛋白表达系统.pdfVIP

大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作， 产量高，成本低，但由于用 E.coli 生产的蛋 质药物因缺乏糖基化而 在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生 内毒素和包涵体的问题。 CHO 细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。 容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表 达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase）营 养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO 细胞。 二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作 用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸还原成 四氢叶酸。对于dhfr 突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻 断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养 基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷 （thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维 持生长。利用dhfr 基因进行筛选时，首先将重组DNA 分子导入dhfr- 表型的受体细胞，然后撤除原培养基中的的次黄嘌呤和胸苷，即可获 得dhfr+并能表达外源基因的克隆细胞系。因此在挑 表达外源基因 的阳性克隆细胞时需 用不含次黄嘌呤和胸苷的培养基。另外，氨甲 喋呤（MTX）选择压力可使CHO/dhfr- 细胞的外源基因的拷贝数扩增并 得到较高水平的表达。 CHO-GS 细胞是用含单抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合 成酶(GS)基因标记的表达载体，转染宿主细胞CHO，再通过L-氨基亚 砜蛋氨酸(methioninesulphoximine，MSX)等化合物选择加压促使GS 基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组细胞株，可在不含谷氨酰胺 培养基中生长、增殖，可避免或减少细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积 累的氨对细胞的损伤、抑制作用。 近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物 细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差， 贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝 试将类胰 岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO 细胞获得能自身分 泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞 可在SFM中生长良好。 与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特 性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗 透压能力；* O! [6 Q P! P4 {. A* i d (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；# N9 s! f4 m* r (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于 下游产物分离纯化；; K- F2 缺点： CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响 了它的广泛应用。 Cho 细胞的培养 CHO 细胞血清培养 传统上CHO 细胞的培养都是在DMEM／F12 基础培养基中添加 5~10 的小牛血清(用于重组蛋 )或胎牛血清(用于杂交瘤生产)单抗来 完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成 DNA，对细胞的增殖有很大的作用。实验证明，血清在细胞的体外培 养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但哺乳动物的血清价格昂贵， 成本高不适于今天的大规模工业化生产。而且哺乳动物血清作为补加 物，存在许多问题，首先血清的来源存在问题，血清来源于特定的地 区，因而如果该地区发生灾荒或牛群中流行疾病，都可导致血清失去 供应源。血清批量之间的差异大，重复性差，由于血清来源于动物，动 物个体或群体的差异及时间上的差异都能导致每个批号的血清