有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶.docxVIP

实验三 有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶 一、实验原理 脲酶( EC3.5.6.5 )广泛存在于微生物和动、植物组织中， 1926 年， Sumner J 曾用 32％的丙酮溶液从刀豆粉中提取脲酶，并得到了结晶。该酶相对分子质量 为 483 000，由 6 个亚基组成，等电点 4.9, 溶于水和稀缓冲液，粗酶较稳定，纯 酶不太稳定， 结晶酶在低温下可稳定 1 年以上。本实验用乙醇或丙酮从大豆种子 中提取脲酶，并用有机溶剂和等电点结合法制备该酶。 二、实验步骤 提取 称取 5g 人造浮石，置小烧杯中，用 2％乙酸浸泡两次，倾去酸，加蒸馏水 反复洗涤至中性，沥干备用。 称取10g新鲜大豆粉，置入锥形瓶中，加上述人造浮石，加 50mL3%丙酮 溶液，在冰浴中持续摇动4min?5min,4层纱布过滤，收集滤液。 将滤渣重新置于锥形瓶中，另加 10mL3%丙酮，再提取一次。4层纱布过 滤，滤液在4°C，3500r ? min - 1条件下离心8min?10 niln ，小心倾出上清液， 计量体积。取 lmL 酶液保存，供测酶活力和蛋白质用。 沉淀 脲酶在 32％的丙酮中可以缓慢聚集而沉淀，但当酶液在等电点附近时，沉淀生 成更快。故： 将提取的酶液置冰浴中，在缓慢搅拌下，用点滴管逐滴滴加 2 ％醋酸，并 不断用精密 pH 试纸检测 pH 变化，观察产生浑浊的现象，直至 pH4 . 9 左右。 置4 C 低温下过夜，可析出沉淀。 将沉淀物仔细转入预冷的离心管，3500 : ?而n —，离心10?。上清液 回收丙酮；沉淀即为脉酶粗品。风干后，称重，计算酶的收得率。 重结晶 将所得粗酶溶于少许蒸馏水中，吸取0.2mL?0.4mL用于测定酶活力和蛋白 质，此即粗酶的活力。 酶溶液在冰浴中冷至 2C?4C ，搅拌下缓慢滴入等体积 64％的预冷丙酮溶 液，保持低温条件下让其缓慢析出结晶， 需要较长的时间， 可得到较好的正方形 晶体。如果将溶液调至等电点结晶，则结晶速度较快，但晶形不够规整。结晶干 燥后低温保存。 三、结果计算 酶收得率(%)=(酶干重+酶干重x测酶活留取液体体积/酶液总体积)十样 品重x 100 % 酶的比活力]U - mg1，( pr.)] =总活力/总蛋白质 报告试验结果及观察到的有关现象记载。酶制备记录表如下： 步骤 总体积 (ml) 酶活力 蛋白质 比活力 -1 U ? mg ( pr.) 收得率 (% ) U ? ml-1 总活力(U) -1 mg- ml 总蛋白质(mg) (l )提取液 (2 )粗酶 (3 )结晶酶 四、仪器与试剂 家用磨粉机、冰浴设备、离心机、5mL 10mL、50mL离心管、1.5mL塑料离 心管及其他常规仪器： 新鲜大豆或大豆粉； 人造移石(专用于吸附氨Permutin颗粒状人造浮石)； 4.2 %醋酸：冰醋酸2mL用蒸馏水稀释至l00mL ; 5.64 %和32%丙酮：丙酮原液按体积百分比用蒸馏水配制。